1 . 某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向为从左往右。为了使细菌产生该酶，以图甲中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题：

限制酶	BamH I	EcoR I	Mfe I	Kpn I	Hind Ⅲ
识别序列及切割位点	G↓GATCC	G↓AATTC	C↓AATTG	GCTAC↓C	A↓AGCTT

(1)限制酶主要是从_______中分离纯化出来的。应使用限制酶____切割图甲中质粒，使用限制酶____切割图乙中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。
(2)质粒中启动子的作用是______________________________，若将正确构建的基因表达载体用MfeⅠ切割，将产生__________种不同长度的DNA片段。
(3)W基因转录的模板链是_______（填“甲链”或“乙链”），利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是____________，子链的延伸方向是______。
(4)研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因与酶切后的载体正确拼接成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为_______。

A．5'-TGAACGCTA…	B．5'-CGAGTCGAC…
C．5'-GAATTCTGA…	D．5'-AAGCTTCGA…

(5)研究人员在以上基础上，欲通过改造W基因的结构来提高该酶的热稳定性，这项工作属于_________工程的范畴，该工程常用到______________技术来进行碱基的替换。

2 . 研究者通过下图所示的操作过程，获得导入S基因的基因编辑小鼠。下列相关叙述正确的是（       ）

A．过程①获得的卵母细胞需培养至MⅡ期

B．过程②在雌鼠a的输卵管内完成受精

C．过程③需将基因表达载体注射到子宫中

D．过程④不需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥

3 . 氟磺胺草醚是一种含氮的有机化合物，它是广泛使用在大豆、橡胶园等作物地的阔叶杂草除草剂。由于氟磺胺草醚在土壤中持效期长，连年施药导致残留量居高不下，造成后茬敏感作物减产甚至绝产。为修复被其污染的土壤，按下面程序选育能降解氟磺胺草醚的降解菌株。已知氟磺胺草醚在水中溶解度低，含过量氟磺胺草醚的固体培养基不透明。

   

据图回答：
(1)图中“某土壤”是指__________土壤。
(2)在土壤细菌的分离纯化过程中，土壤样品一般经梯度稀释后再涂布平板，原因是____________。在固体培养基中，出现无透明带菌落的原因可能是_________。
(3)某真菌的G基因可编码一种高效降解氟磺胺草醚的酶，为获取高效降解菌株，以下图中质粒为载体，进行转基因。已知图中G基因转录方向是从左往右。

   

限制酶	BamHI	KpnI	EcoRI	MfeI	HindⅢ
识别序列和切割位点（5'-3'）	G↓GATTC	GGTAC↓C	G↓AATTC	C√AATTG	A↓AGCTT

应使用限制酶___________切割图中质粒，使用限制酶__________切割图中含G基因的DNA片段，以获得能正确表达G基因的重组质粒。

4 . 通常真核细胞翻译的起始必须依赖于mRNA的5’端帽子结构，而内部核糖体进入位点（IRES）则是位于mRNA内部的核糖体识别、结合序列，IRES使翻译可以从mRNA内部开始。人溶菌酶和人乳铁蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人员构建人溶菌酶基因（bLYZ）和人乳铁蛋白基因（hLTF）双基因表达载体，并获得转基因牛胚胎。下图表示双基因表达载体的主要构建过程，请回答下列问题：

(1)图中IRES序列的基本单位是_____。与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是_____。
(2)为实现bLTF与IRES序列的连接，在PCR扩增基因片段时通常在引物的_____端添加特定的限制酶识别序列。
(3)过程①需用限制酶_____切割质粒a、b，再用电泳法分离，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段用_____连接，获得重组质粒1。
(4)用限制酶BamH对过程②形成的重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段大小为_____。
(5)科研人员以包含重组质粒2的脂质体转染乳腺上皮细胞时，需在细胞培养液中加入一定浓度的_____以筛选导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞。培养液中添加H₂PO₄^-、HPO₄^2-和HCO₃^-；的作用是_____。
(6)为检测转基因奶牛体内的hLYZ和hLTF是否成功表达，可以采用的方法是_____。

5 . 如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pB1121）结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的是（       ）

   

A．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中

B．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞

C．用限制酶BsaB1和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因

D．与只用KpnI相比，KpnI和XhoI处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确

6 . RDX是某种军用弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，让转基因植物修复因军用炸药RDX污染的土壤。基因XplA和XplB与引物结合位点及模板链分布情况如图1所示。图2为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答下列问题：
(1)从细菌中提取DNA的过程中，使用预冷酒精（体积分数为95%）初步分离DNA与蛋白质，原理是___________。
然后再利用PCR的方法从提取的DNA中获取目的基因，在PCR的反应体系中，引物的作用是____________，DNA聚合酶需要________激活。

(2)若要构建图2中的融合基因，应选择图1的引物组合________________，以便通过PCR检测其中的XplA和XplB基因形成的融合基因是否准确。
(3)将融合基因与农杆菌Ti质粒的T-DNA重组，构建基因表达载体。用Ca²+溶液处理农杆菌后使其处于_______________的状态，将其与基因表达载体混合一段时间，在添加______________的培养基中，经筛选得到含基因表达载体的农杆菌。通过农杆菌的___________作用，就可以使融合基因进入植物细胞。
(4)用上述农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解RDX物质，原因是_____________。

7 . 科研人员通过基因工程将Ipp20基因导入大肠杆菌体内并进行扩大培养。如图所示为部分过程，图2中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图所示）。回答下列问题：

   

(1)在构建基因表达载体的过程中，质粒载体的目的基因上游通常需要有______碱基序列，是______识别位点，能驱动______。
(2)将构建好的目的基因导入大肠杆菌细胞时，通常需要用______处理大肠杆菌，处理后的大肠杆菌能______，从而有利于目的基因进入其体内。
(3)已知在构建载体时，目的基因插入到了庆大霉素抗性基因序列中，但未改变质粒上青霉素抗性基因序列，则培养基A、B分别添加了______，以便于对大肠杆菌进行筛选，图中菌落______中含有目的基因。

8 . 牛凝乳酶是一种在未断奶的小牛胃中发现的蛋白酶，它能促使牛奶凝结来生产奶酪。然而，牛凝乳酶的供应量有限，科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌中，以希望实现牛凝乳酶的批量生产，其中目的基因和质粒的示意图如图所示，NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ表示限制酶。回答下列问题：

(1)科学家从牛胃黏膜细胞中提取mRNA，通过______形成cDNA，再利用PCR技术获得目的基因，上述两个过程所需要的原料是______（填“相同”或“不同”）的。
(2)根据图中信息分析，为了将目的基因和质粒重组，需要使用限制酶和______酶，其中应选择的两种限制酶是______，不选择另外一种限制酶的原因是______。
(3)将目的基因和质粒连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌中。选择大肠杆菌作为受体细胞，是因为大肠杆菌具有______（答出2点）等特点。为初步筛选重组质粒是否导入大肠杆菌细胞中，需要在培养基中添加______（填“氨苄青霉素”或“四环素”）。
(4)通过实验获取了A、B两组成功导入了重组质粒的大肠杆菌，将这两组大肠杆菌在适宜条件下培养一段时间，将两组大肠杆菌表达出的产物加入牛奶中，发现A组牛奶未凝结，B组牛奶出现凝结现象，该结果说明了______。

9 . 红豆杉被称作“植物界的大熊猫”，紫杉醇具有高抗癌活性。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，此方法不利于对它们的保护。根据材料回答下列问题：
(1)为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下：

①Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，需要的引物有_____（从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段至少要经过_____次循环，可获得与Bapt基因等长的DNA单链。
②构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞；在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是_____。
③Bapt基因的检测和鉴定。将受体细胞经农杆菌液浸泡，Bapt基因会随T-DNA整合到受体细胞染色体上，继而进行植物细胞组织培养，培养基中加入_____进行筛选。
(2)PCR技术可用于目的基因的扩增，为确保准确性，在设计PCR引物时必须注意：用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，过短会导致特异性差，过长则会使反应体系有关步骤温度提高，从而超过_____的最适温度；引物3'端的碱基最佳选择是_____（填“G和C”或“A和T”），这样形成的碱基配对比较稳定，引物的“_____”端（用5或3'作答），可以被修饰，如附加限制酶位点等；连续扩增4次后需要引物至少_____个。扩增完成以后，常采用_____法来鉴定PCR的产物

10 . 下图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有820个碱基对（bp），质粒有5369个碱基对（bp）。请据图回答问题：

   

(1)基因工程的核心步骤是_________，该过程需要的基本工具包括：____________。过程①②用相同的两种限制酶切割，与单一酶相比，优势是______________。
(2)过程②目的基因的扩增可通过PCR技术实现，PCR扩增目的基因的原理是：_____________________，进行PCR时除提供DNA母链、4种脱氧核苷酸外，还需要________________（至少填两个）等基本条件。PCR可呈指数形式扩增目的基因，每个循环一般可分为_____________三步。
(3)已知图中质粒经BamHI、HindIII双酶切后进行电泳，若出现一条长度为5150bp的DNA条带，则重组质粒长度为____________的DNA片段条带。
(4)若想获得发绿色荧光的小鼠，可将重组质粒用________法导入小鼠的__________（细胞）中。
(5)若想获得发绿色荧光的植物，最常用___________方法将重组质粒导入植物体细胞。