2 . 热激蛋白是一种普遍具有抗逆作用的保护蛋白，在植物处于逆境下发挥其重要的调控作用。HSP70是植物中含量最多的热激蛋白，研究已经证明南瓜细胞中HSP70基因的表达与植物获得的耐热性呈显著正相关性。花楸树为蔷薇科落叶小乔木，具有很高的园林观赏价值，但花楸树引种到低海拔地区后面临着严峻的夏季高温环境胁迫，其正常生长及观赏价值会被影响。欲将南瓜细胞中的HSP70基因（结构如图1所示，其中B链是模版链）用图2所示的质粒导入花楸树细胞来研究其表达与耐热性之间的关系。回答下列问题：

注：XhoI、KpnI、SacI为三种限制酶，其识别位点分别是5'CTCGA↓G、5'G↓GTACC、5'GAGCT↓C；Amp^R基因为氨苄青霉素抗性基因。
(1)可通过提取南瓜细胞中的____经逆转录获得HSP70基因，并用PCR对其进行扩增。在PCR扩增HSP70基因时应选择的引物组合是引物____。为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需在引物____（填“I”“Ⅱ”“Ⅲ”或“IV”）的5'端添加-CTCGAG序列。
(2)通过农杆菌转化法转化花楸树细胞后，可以使用含____的选择培养基筛选出含有目的基因的花楸树细胞。将某细胞培育为植株后进行自交，收获子代植株641株，其中不耐高温的植株为42株，不考虑突变和互换，出现该结果的原因最可能是____。
(3)为了检测目的基因是否成功导入，从分子水平上可用PCR技术进行检测，以花楸树细胞提取的DNA为模板，PCR扩增HSP70基因片段后进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图3（M为泳带标准，1号为空白对照，2、3号为转基因植株）所示。若与1号相比，2号花楸树植株的耐热能力并没有增强，原因可能是____。若要进一步检测目的基因在转基因植物中是否成功表达，从分子水平上可通过____法进行检测。

4 . 科学家利用基因工程改造的大肠杆菌基因组生产人胰岛素，如图是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。回答下列问题：

   

(1)适合作为目的基因的载体需要满足一些条件，根据基因表达载体的组成分析，图中质粒没有标出的结构是_____，该结构的作用是_____。
(2)大肠杆菌内目的基因转录时，转录的模板是______（填“a链”或“b链”），目的基因表达产物没有生物学活性的原因是____。
(3)某同学尝试用PCR扩增目的基因。PCR利用的原理是______，一次PCR一般要经历30次循环，每次循环的步骤是________。
(4)在PCR反应体系中，主要成分有缓冲液、4种脱氧核苷酸、两种引物、_____等。其中引物的作用是_____。
(5)PCR的产物一般通过_____来鉴定。影响DNA分子在凝胶中的迁移速率的因素有______等（例举出2点即可）。

5 . 如图表示某质粒的结构示意图。下列叙述错误的是（　　）   

A．构建基因表达载体时目的基因插入在启动子和终止子之间

B．由该质粒的限制酶识别位点可知，可选择EcoRI和HindⅢ切割质粒

C．启动子能与RNA聚合酶结合，驱动相关基因转录出相应的mRNA

D．该质粒中标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选

6 . 稻田生物固氮作用是稻田氮素循环的关键环节，某些蓝细菌是自生固氮菌（独立生活时能够利用空气中游离的氮分子作为氮源，并将氮分子转化为氨，氨转化为铵盐后是植物良好的氮素营养）。蓝细菌中B基因（长度为0.9kb）表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO₃的载体蛋白，科学家利用基因工程等技术，尝试将蓝细菌的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收NO₅能力较强的转基因水稻，从而增加粮食产量。下图1是农杆菌的Ti质粒结构图（Tet、Amp'分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因），图2为蓝细菌B基因的结构模式图。回答下列有关问题：

限制酶	BamH I	Bcl I	Sma I	Sau3A I
酶切位点	5’-G↓GATCC-3’	5’-T↓GATCG-3’	5’-CCC↓GGG-3’	5’-↓GATC-3’

(1)目的基因的获取：利用从细菌中提取的DNA通过PCR技术获取B基因时，除了需要向反应体系中加入DNA模板，缓冲液（含Mg²⁺），还需要加入_______（至少写两种）等。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的5’端分别引入_______两种不同限制酶的识别序列。
(2)基因表达载体的构建：①用（1）中选取的限制酶同时对目的基因和载体进行酶切，得到酶切产物后，再选用_________（填“E.coli DNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）将目的基因和载体进行连接，得到重组载体，随后进行转化操作。②为筛选获得目的菌株，将转化后的大肠杆菌接种在含______的固体培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图，______号菌落的质粒很可能是含B基因的重组质粒，并进行测序验证。

注：M为指示分子大小的标准参照物：小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(3)将重组的Ti质粒转入农杆菌，利用农杆菌的转化作用将目的基因导入水稻细胞。目的基因的检测与鉴定：为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可通过PCR、抗原-抗体杂交等技术在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路________。

7 . 人血清白蛋白（HSA）主要由肝细胞产生，在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。如图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中I、II、III、IV是四种不同的限制酶，具各自识别的酶切位点如表所示。

限制酶	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
识别序列及切割位点

(1)若要将HSA基因正确插入质粒中，最好选择限制酶____进行共同切割，重组基因表达载体中的启动子的作用是____。
(2)为筛选出含重组质粒的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，生长情况如下图所示，则成功导入目的基因的重组质粒的菌落类型是____类，未导入质粒的菌落类型是____类；（填字母类型）

(3)科研人员提取人肝细胞中的mRNA，并通过反转录法构建了HSA基因，该基因其中一条链的序列为（5'-CCGATCGTTGGAGA…GAATTTCGACCTAG-3'），若通过PCR进行扩增，已知其中一种引物I是5'-CTAGGTCGAAATTC-3'，则另一种引物的序列为____（答出6个碱基序列即可）。
(4)PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法。电泳一段时间后进行检测，若电泳带有____条，且与DNAMarker对比，产物大小正确，表明PCR扩增成功。
(5)有人提议将乳腺反应器改成膀胱反应器，请分析利用膀胱反应器比乳腺反应器产量高的原因____（答出两点即可）。

8 . 如图为科学家采用不同方法培育良种牛的过程，请据图回答有关问题：

(1)为提高良种奶牛的繁殖能力，在获取卵母细胞之前需用____对奶牛进行处理，目的是超数排卵。
(2)“转基因牛D”培育过程中，常用受精卵作为外源基因的受体细胞，主要原因是____。
(3)图中数字标号①代表的结构为____，①将来发育为____。
(4)c→d过程均等分割的原因是____。
(5)在培育良种牛的过程中，运用了动物细胞培养技术。在动物细胞培养过程中，需要定期更换培养液，原因是____（答出两点即可）。

9 . 如图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄植物的过程示意图，下列叙述不正确的是（　　）

A．农杆菌转化法普遍适用于大多数双子叶植物和裸子植物

B．过程A需要限制酶和DNA连接酶的参与，可将重组质粒直接侵染植物细胞

C．抗病毒基因整合到番茄细胞的染色体DNA上需要借助T－DNA的转移

D．转基因抗病毒番茄植株是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定

10 . OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR 4个基因分别编码4种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述不正确的是（　　）

A．OsGLO1启动子启动转录的方向与其他两个基因不同

B．应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞

C．可用抗原—抗体杂交技术检测4种酶在转基因水稻中的表达量

D．插入的4个基因以DNA的同一条单链为模板进行转录