1 . 猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性肠道传染病。PEDV是一种正链单股RNA病毒，PEDV基因组共编码蛋白21种，这些蛋白共同协调着病毒的复制与增殖。其中Nsp10蛋白对基因组RNA合成以及病毒多聚蛋白的加工有着极其重要的作用。研究人员构建了PEDV Nsp10基因真核表达载体，为进一步探究PEDV Nsp10蛋白的生物学功能以及特性奠定一定的基础。请回答下列相关问题：
(1)对于PEDV而言，基因指的是______。PEDV在细胞中的增殖过程如图1所示。PEDV感染细胞后，其基因组既可作为______翻译出病毒特异的蛋白质，又能够作为模板经过______次复制得到子代病毒的基因组。

   

(2)Nsp10基因不能直接进行PCR扩增，需要经______过程得到相应的产物再进行PCR扩增。为了便于扩增后的DNA片段与表达载体连接，需在引物的______（填“3′端”或“5′端”）加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是______。
(3)扩增Nsp10基因的特异性引物分别为：
引物Ⅰ序列：5′－GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT－3′，
引物Ⅱ序列：5′－CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT－3′
下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点，图2质粒上的Amp^r代表青霉素抗性基因，其作用是______，ori为复制原点，其余为限制酶切割位点，由此推断切割质粒选择的限制酶是______。

限制酶名称	识别序列和切割位点
BamH Ⅰ	5′－G↓GATCC－3′
EcoR Ⅰ	5′－G↓AATTC－3′
Xho Ⅰ	5′－C↓TCGAG－3′

   

(4)该真核表达载体可导入猪小肠上皮细胞中进行表达，培养猪小肠上皮细胞可以采用______技术，需要培养在______气体环境中。

2 . CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，能够通过“剪切和粘贴”DNA序列的机制来编辑基因组。Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，识别并切割目标DNA双链的特定序列（DNA靶序列）以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

   

(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是_________。CRISPR/Cas9重组质粒上除了有目的基因（Cas9基因和SgRNA编码序列）和标记基因外，还应该含有_________、_________等。
(2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列，二者结合所遵循的原则是_________。Cas9蛋白相当于_________酶，可催化_________键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，导致_________（填变异类型），改变基因结构。
(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变_________的碱基序列，从而可以任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来，一般需要设计_________种不同的SgRNA。
(4)CRISRP/Cas9基因编辑技术中常用的SgRNA长度为20bp左右。某SgRNA因细胞内其他DNA序列也含有与其相对应的序列，造成该SgRNA错误结合而脱靶，解决的具体措施是_________。
(5)单细胞生物没有免疫系统，但广泛存在CRISPR/Cas9等系统，这对细菌来说的意义是_________。

3 . 甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，某甜蛋白基因编码区共含1178个碱基对（如图1）。为改善黄瓜的品质，科学家将该甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。科学家利用PBI121质粒（如图2），以及两种限制酶，运用农杆菌转化法，将该甜蛋白基因导入黄瓜试管苗叶片细胞，再经植物组织培养获得甜蛋白基因过量表达的转基因黄瓜植株。请回答下列问题：

(1)限制酶切割DNA分子的时候破坏的化学键是___________。上述实现转基因技术过程中，科学家利用了如图2所示PBI121质粒，为了保证目的基因能够正确插入质粒，切割目的基因及PBI121质粒可用的限制酶为___________，若重组质粒利用SacI该过程属于基因工程的核心工作——__________和HindⅢ切割后能得到___________bp左右的片段，则表明目的基因正确插入质粒。
(2)转入甜蛋白基因后的黄瓜细胞，转化后应在培养基中添加___________（填“新霉素”或“卡那霉素”或“新霉素和卡那霉素”），筛选转化成功的愈伤组织。若要获得产甜蛋白能力更强的基因，可以对甜蛋白基因进行改造，最终得到更多的甜蛋白，该过程可以通过蛋白质工程完成，基本思路为__________（用文字和箭头表示）
(3)下表是鉴定含甜蛋白基因黄瓜植株的4种方法。请预测同一后代群体中，通过4种方法检出的含甜蛋白基因黄瓜植株的比例，从小到大依次是__________。

方法	检测对象	检测目标	检出的含甜蛋白基因植株的比例
PCR扩增	基因组DNA	甜蛋白基因	P1
分子杂交	总mRNA	甜蛋白基因转录产物	P2
抗原——抗体杂交	总蛋白质	甜蛋白基因编码的蛋白质	P3
测甜度	黄瓜	含甜蛋白基因黄瓜	P4

5 . 血栓调节蛋白（TM）只能在血管内皮细胞中合成，具有调节凝血的功能。为了解决异种器官移植时引起凝血紊乱的问题，科研人员研究制备了猪血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白（hTM）的转基因猪。下图1表示部分研究过程，请回答：

注：ori是复制原点，T为终止子，puro为嘌呤霉素抗性基因，pTM为猪血栓调节蛋白，相关限制酶识别
序列及切割位点如下表：

限制酶	XhoI	claI	EcoRV
识别序列及切割位点	C↓TCGAG	AT↓CGAT	GAT↓ATC

(1)步骤①将pTM启动子插入到质粒1中，其中pTM启动子的作用是：____。
(2)步骤②设计引物时，应该在引物____端加入claI和EcoRV两种限制酶的识别序列。
(3)步骤③将hTM编码区插入质粒2中，该过程中至少需要____种酶，分别是：____。
(4)步骤③获得的质粒3经XhoI、EcoRV酶切后电泳，结果如下图2，据结果可判断目的基因____（填“成功插入”或“未插入”）质粒。

(5)质粒3导入猪胎儿成纤维细胞常用的方法是____。将处理后的成纤维细胞接种至培养皿中培养48h后经____处理分散成单个细胞，再按每孔一个细胞接种至96孔板（如上图）中，加入_____筛选获得抗性细胞，再提取抗性细胞的DNA进行PCR鉴定，将呈阳性的细胞留存待用。
(6)取留存细胞的细胞核，显微注射到____中，再经过____等技术（至少两种）获得表达人血栓调节蛋白的转基因猪。

7 . 双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　）

A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞

B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒

C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞

D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用

8 . 红豆杉被称作“植物界的大熊猫”，紫杉醇具有高抗癌活性。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，此方法不利于对它们的保护。根据材料回答下列问题：
(1)为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下：

①Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，需要的引物有_____（从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段至少要经过_____次循环，可获得与Bapt基因等长的DNA单链。
②构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞；在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是_____。
③Bapt基因的检测和鉴定。将受体细胞经农杆菌液浸泡，Bapt基因会随T-DNA整合到受体细胞染色体上，继而进行植物细胞组织培养，培养基中加入_____进行筛选。
(2)PCR技术可用于目的基因的扩增，为确保准确性，在设计PCR引物时必须注意：用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，过短会导致特异性差，过长则会使反应体系有关步骤温度提高，从而超过_____的最适温度；引物3'端的碱基最佳选择是_____（填“G和C”或“A和T”），这样形成的碱基配对比较稳定，引物的“_____”端（用5或3'作答），可以被修饰，如附加限制酶位点等；连续扩增4次后需要引物至少_____个。扩增完成以后，常采用_____法来鉴定PCR的产物

9 . 科研工作者构建了含有人干扰素基因的表达载体，然后将其导入大肠杆菌，再通过发酵工程就能大量生产人重组干扰素，生产的人重组干扰素可用于慢性肝炎及肿瘤的临床治疗。下列叙述正确的是（       ）

A．将人干扰素基因插入表达载体的启动子和终止子之间

B．大肠杆菌常用作受体细胞的主要原因是其易接受外源DNA

C．导入重组质粒的大肠杆菌一般先用Na+处理

D．人重组干扰素作为抗体用于慢性肝炎及肿瘤的临床治疗

10 . 为培育含β­胡萝卜素的“黄金大米”，科研人员提出两套方案。下列叙述正确的是（       ）

A．甲方案中，β­胡萝卜素基因能在玉米和水稻体内出现相同表达结果

B．乙方案中，在体细胞杂交前需要用吸水涨破法去除细胞壁获得原生质体

C．诱导原生质体融合的方法同动物细胞融合的方法相同

D．通过⑤获得“黄金大米”幼苗过程，除了在培养基中添加营养物质外，还需添加血清