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题型:非选择题-解答题 难度:0.4 引用次数:524 题号:12288585
阅读下列材料,并回答问题:
纤维素酶的分子改造
纤维素酶的分子改造先后经历了以下 3 个阶段:以定点突变为基础的“定点理性设计”;以易错 PCR等技术主导的“定向进化”;以数据驱动设计或结构生物信息学指导的“结构理性设计”。

20世纪80年代,随着定点突变技术的快速发展,纤维素酶理性改造策略应运而生。该技术的基本思路是:先研究分析纤维素酶的三维结构信息,再基于对其结构与功能关系的理解,选定特定的氨基酸进行改造,找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。常用的定点突变技术是重叠延伸PCR(过程如图1),可对目的基因特定碱基进行定点替换、缺失或者插入,实现对目的蛋白的改造。
然而,目前仅获得了纤维素酶家族的少数成员三维结构,通过定点突变为代表的理性设计进行纤维素酶分子的改造在短期内仍难以获得广泛的成效。因此,采用“非理性”设计就成为一种重要的研究手段。所谓“非理性”设计,即定向进化,就是在对蛋白质的三维结构及催化机制不是很清楚的条件下,模拟自然进化过程,利用易错PCR等技术对基因进行随机突变,提高基因突变频率和基因突变的多样性,并与定向筛选策略相结合,最终获得具有某些优良特性的酶分子(过程如图2)。

尽管定向进化技术在对纤维素酶进行改造时可能会得到意想不到的“有益收获”,但由于对要改造的蛋白质分子结构信息并不清楚,因此操作起来具有明显的“盲目性”。
近十年随着计算机运算能力大幅提升以及先进算法不断涌现,计算机辅助蛋白质设计改造得到了极大的重视和发展,形成了“结构理性设计”的新策略。这一策略借助蛋白质保守位点及蛋白质的三维结构分析,通过非随机的方式选取若干个氨基酸位点作为改造靶点,并结合有效密码子的理性选用,构建“小而精”的突变体文库。与定向进化相比,“结构理性设计”可提供明确的改造方案,大幅降低建立、筛选突变体文库所需的工作量,增大理性设计成功的概率。
(1)纤维素酶的分子改造过程属于_____工程。
(2)根据图1所示的重叠延伸PCR过程,回答下列问题。
①该过程应该分别选择图中所示的哪种引物?请填写以下表格(若选用该引物划“√”,若不选用该引物划“×”)。_____
引物a引物b引物c引物d
PCR1
PCR2
重叠延伸

②重叠延伸PCR通过_____实现定点突变,引物b和c上的突变位点的碱基应_____。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是______
(3)请据图2写出用定向进化策略改造纤维素酶的操作过程____
(4)用定向进化策略改造纤维素酶,下列哪些说法正确?_____
A.定向进化策略可以使纤维素酶朝着人们需要的方向进化
B.定向进化策略获得的纤维素酶的基因序列在筛选前是已知的
C.定向进化策略的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用
D.与定点诱变相比,定向进化策略不需解析酶的结构和功能,更接近自然进化过程
E。基因工程技术是定向进化策略改造纤维素酶的基础
(5)有人认为,以数据驱动设计或结构生物信息学指导的“结构理性设计”必将成为纤维素酶的分子改造的主流方向。该说法是否正确,请结合本文作出判断,并撰写一段文字,向公众进行科学解释_____

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【推荐1】酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力,有助于发酵后细胞和产物的分离,节约生产成本。科研人员为研究R基因对酵母菌絮凝性能的影响,用基因工程技术获得了R基因被敲除的酵母菌菌株,主要步骤如图1(G418为一种氨基糖苷类抗生素)。请据图回答下列问题。

(1)过程①中,引物2和引物4分别添加了MluⅠ的识别序列,则引物1和引物3的5'端分别添加_____________的识别序列,PCR获取R基因左右两端的N和C片段过程中,除了图中条件外,还需提供_____________等条件(至少写三个)。
(2)过程②所需的工具酶有_____________。过程③将构建的重组质粒用_____________酶将其线性化后转化进受体酵母菌。
(3)利用含_____________的培养基筛选出重组酵母,再挑取单菌落进行PCR扩增,验证酵母细胞R基因是否被敲除,则扩增时选择引物组合是_____________
(4)科研人员继续将野生酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中,一定条件下静置发酵7天,测定酒精发酵能力和絮凝能力,结果如下表。

指标

种类

酒精发酵能力

絮凝能力

野生酵母菌

4.5%

63.1%

R基因敲除酵母菌

4.5%

83.1%


①酒精发酵期间,每个锥形瓶应注意保持_____________条件和定期排气。
②实验结果表明,R基因敲除酵母菌是否符合生产需求?请说出你的判断依据。_____________
(5)科研人员进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制。
①将R基因敲除酵母菌和野生酵母菌分别用无菌水进行梯度稀释,再将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30g/mL钙荧光白(细胞壁抑制剂,破坏细胞壁的正常组装)的YPD培养基上,培养基中除了必需营养物质外还需添加_____________,培养适当时间后结果如图2。

(注:YPD培养基—酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基)
②综合上述实验结果,推测R基因敲除酵母菌絮凝能力变化的原因是_____________
2023-03-01更新 | 608次组卷
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【推荐2】下图表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列,图右表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4种限制性核酸内切它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。

(1)若用限制酶SmaI完全切割图中含有目的基因D的DNA片段,其产物长度分别为__________________。 若图左DNA分子中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子中分离出图示对应的DNA片段,用限制酶Sma I完全切割,产物中共有__________种不同长度的DNA片段。
(2)为了提高试验成功率,需要通过________技术扩增目的基因,以获得目的基因的大量拷贝。在目的基因进行扩增时,加入的引物有A、B两种,若该目的基因扩增n代,则其中含有A、B引物的DNA分子有_______个。
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挑选目的菌的位置为_____________
(5)若目的基因在工程菌中表达产物是一条多肽链,如考虑终止密码,则其至少含有的氧原子数为_____
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