【推荐3】宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（HPV）诱发，癌细胞转移成为影响病人预后的重要因素。基因沉默技术可通过阻断特定基因的异常表达进行调控，发挥治疗作用。科研人员进行了“PIK3CA基因沉默抑制PI3K/AKT信号通路的激活，对宫颈癌EMT的影响”的探究。EMT在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。E－钙黏蛋白、N－钙黏蛋白和波形蛋白是EMT的重要标志性因子。下表为相关探究步骤，请回答：

探究步骤	具体内容
观察分析、提出问题	前期研究发现PIK3CA基因与宫颈癌密切相关，PI3K/AKT信号通路的激活参与肿瘤的发生发展。抑制肿瘤EMT能提高治疗效果和改善预后。由此提出问题：是否能抑制PI3K/AKT信号通路的激活进而抑制宫颈癌细胞发生转移？
提出假说	通过基因沉默技术抑制PIK3CA基因表达，可使PI3K/AKT信号通路的激活被抑制，导致EMT有关的①______的表达受影响，从而防止癌细胞的转移扩散。
演绎推理、作出预期	通过基因沉默技术可抑制PIK3CA基因表达，使PIK3CA、PI3K、AKT的表达量显著降低，使得PI3K/AKT信号通路的激活受到抑制，进一步导致EMT有关的E－钙黏蛋白、N－钙黏蛋白和波形蛋白的表达受到影响，抑制宫颈癌细胞的转移。
②______	设计以下六组实验：a组（人宫颈癌细胞）、b组（人宫颈癌细胞＋转染空白载体质粒）、c组（人宫颈癌细胞＋转染PIK3CA过量表达载体）、d组（人宫颈癌细胞＋转染PIK3CA抑制表达质粒）、e组（人宫颈癌细胞＋PI3K/AKT信号通路拮抗剂）以及f组（③______），进行相关实验。
④______	测定PIK3CA、PI3K、AKT以及EMT标志蛋白的表达量。

(1)请补充完成表格中的内容：①______ ；②______；③______；④______。
(2)实验中，选择宫颈癌细胞系HeLa置于气体环境为含有95%空气和 5%CO₂的混合气体的37℃恒温箱中进行传代培养，收集细胞悬液进行6组实验。实验设置b组的目的是______。
(3)实验采用实时定量PCR（qRT－PCR）和蛋白质印迹技术检测转染后各组细胞的特定基因表达情况，前者主要用来直接检测基因的______水平，后者需要进行凝胶电泳并制备特定表达蛋白的一抗和酶标二抗用以显色，通过单克隆抗体制备二抗的过程中需要给受体动物多次注射______以刺激机体产生相应的免疫细胞。
(4)实验结果显示d、e、f组宫颈癌细胞的转移明显受到抑制，细胞凋亡率明显增加。下图是利用蛋白质印迹技术检测到的特定蛋白的表达情况（灰度越深表达量越高）。

分析图1实验结果可知：沉默PIK3CA基因与______均能降低PIK3CA、PI3K、AKT的表达，且两者效果具有______；分析图2实验结果可知E—钙黏蛋白对宫颈癌细胞的转移具有______作用。