金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过___________ 获得___________ 用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的___________ 位点。设计引物时需要避免引物之间形成___________ ,而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表高温变性,可以使双链___________ ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏___________ 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但___________ 的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有___________ (填序号:①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物)。
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的
(3)图中步骤1代表高温变性,可以使双链
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有
更新时间:2018-11-29 16:47:15
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【知识点】 PCR扩增的原理与过程解读
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【推荐1】水蛭素为水蛭蛋白的重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。研究人员运用蛋白质工程对水蛭素基因进行改造,获得了抗凝血能力较高的水蛭素。
(1)蛋白质工程是指以________ 及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需要。蛋白质工程的基本思路如下图所示,在生产过程中,物质b可能不同,却合成了相同的物质a,原因是________ 。(2)在未知水蛭素三维结构和功能关系的情况下,可以通过易错PCR技术引入随机突变,再进行定向筛选,易错PCR与普通PCR相似,每次循环也包括了________ 三步,但可通过改变PCR反应条件来提高碱基错配的几率。在PCR反应体系中,Mg2+可以提高已发生错配区域的稳定性,Mn2+可以降低DNA聚合酶对底物的专一性,据此分析,与普通PCR相比,易错PCR的反应体系中应________ 。通过多轮的易错PCR及筛选,可以获取所需的水蛭素基因。
(3)研究人员对比改造前后的两种水蛭素,发现改造后的水蛭素的第35位氨基酸发生了替换,其抗凝血能力升高,推测原因是________ 。
(1)蛋白质工程是指以
(3)研究人员对比改造前后的两种水蛭素,发现改造后的水蛭素的第35位氨基酸发生了替换,其抗凝血能力升高,推测原因是
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【推荐2】IKK激酶由IKKα、KKβ和IKKγ三种亚基组成,该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C,导致IKKβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠,主要过程如下图1、2。
(1)在PCR反应体系中,需要加入引物和IKKB基因外,还需要加入________ 等。在图1获取突变基因过程中,需要以下3种引物:
引物A:5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'(下划线字母为突变碱基)
引物B:5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'(下划线部分为限制酶Hind Ⅲ识别序列)
引物C:5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'(下划线部分为限制酶Sac Ⅰ识别序列)
则PCR1中使用的引物有________ ,PCR2中使用的引物有________ 和图中大引物的________ (填“①”或“②”)链。
(2)图2模型鼠培育过程中杂合模型鼠(F0)的培育涉及了一系列现代生物技术,下表是其中的一些步骤,请根据题意完成表格内容。
(3)根据图2杂交结果,可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的染色体上,在遗传时遵循________ 定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳,结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制:________________________________ 。
(1)在PCR反应体系中,需要加入引物和IKKB基因外,还需要加入
引物A:5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'(下划线字母为突变碱基)
引物B:5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'(下划线部分为限制酶Hind Ⅲ识别序列)
引物C:5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'(下划线部分为限制酶Sac Ⅰ识别序列)
则PCR1中使用的引物有
(2)图2模型鼠培育过程中杂合模型鼠(F0)的培育涉及了一系列现代生物技术,下表是其中的一些步骤,请根据题意完成表格内容。
过程 | 实验目的 | 步骤要点 |
导入 | a.处理突变基因与载体 | ① |
b.构建重组载体 | 利用DNA连接酶催化突变基因和载体连接 | |
c.导入目的基因 | ② | |
发育 | d.获取早期胚胎 | 利用专用培养液培养受精卵,并检测其发育状况 |
e.代孕获得小鼠 | ③ | |
f.鉴定、筛选F0小鼠 | 利用PCR鉴定基因,筛选出杂合鼠F0 |
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【推荐3】烟草是有重要经济价值的双子叶植物,易受TMV(烟草花叶病毒)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因,能抵抗TMV感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草,操作流程如图所示。回答下列问题:
(1)过程①是____________ ,涉及的碱基互补配对有________ 种,过程②采用的方法是PCR,为了方便目的基因与Ti质粒连接,在______________ 添加合适的限制酶识别序列。
(2)PCR技术的原理是_____________ ,一般包括______________ 和延伸三个步骤,延伸的过程是以____________ 为模板,在耐高温的DNA聚合酶的催化下,按照碱基互补配对原则将4种游离的脱氧核苷酸连接到___________ 。
(3)过程④最常用的方法是____________ ,过程⑤用到的细胞工程技术是___________ 。获得的转基因植株需要进行________________ 的检测才能投入生产。
(1)过程①是
(2)PCR技术的原理是
(3)过程④最常用的方法是
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