8. 非霍奇金淋巴瘤是一种原发于淋巴组织的血液系统恶性肿瘤,其细胞表面高表达CD19蛋白。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法是利用基因工程的方法使T细胞表面表达能够靶向特定抗原的受体(CAR),改造后的T细胞被称为CAR-T,可以识别并攻击带有特定抗原的肿瘤细胞,同时激活机体自身免疫从而达到抗肿瘤的效果。请回答下列问题:
(1)目前制备CAR-T细胞大多是采用慢病毒感染的方式使T细胞表达CAR。
①获取CAR基因(实质为抗CD19蛋白的抗体基因):将抗CD19蛋白的抗体基因作为PCR反应的模板,并依据
_____设计一对特异性引物来扩增该基因。
②构建基因表达载体:图1为所用载体示意图,表格为限制酶的识别序列及切割位点。为使目的基因与载体正确连接,在扩增目的基因时,应在其一对引物的
_____端分别引入
_____两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时,可选用
_____(选填“E。coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。
③将目的基因导入受体细胞:将重组质粒通过
_____技术导入到T细胞。
④重组质粒的筛选与鉴定:将转化后的T细胞置于含
_____的培养基上进行培养,进一步通过流式细胞术验证CAR-T细胞的构建是否成功。
(2)采用病毒作为递送载体存在随机插入的安全隐患,CRISPR/Cas9技术作为第三代基因编辑工具(图2),sgRNA可引导Cas9蛋白在特定位点进行切割来完成基因的编辑。科学家利用该技术制备的CAR-T细胞,在非霍奇金淋巴瘤临床前的治疗中取得理想效果。其操作原理如图3所示。
①sgRNA能与靶基因特异性识别、结合的原理是
_____,基因编辑工具中对基因进行剪切的是
_____。
②肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白和T细胞表面的PD-1受体结合,发出免疫抑制信号,实现免疫逃逸。该研究团队利用CRISPR/Cas9技术切割T细胞中PD-1基因的同时导入靶向PD-1基因的同源重组序列,利用同源重组修复的原理将
_____重组在PD-1基因内部,制备了非病毒定点整合的CAR-T细胞,如图3。
③综合上述信息分析,与慢病毒制备的CAR-T细胞相比,该方案制备的CAR-T细胞在非霍奇金淋巴瘤的治疗中的优点有:可以
_____插入抗CD19蛋白的抗体基因,降低随机插入的安全隐患,提高CAR-T细胞的安全性;可以使PD-1基因突变,降低肿瘤细胞
____ 的可能性,提高CAR-T细胞的有效性。