1 . 2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是（       ）

   

A．sgRNA通过与目标DNA序列互补配对引导Cas9蛋白到位

B．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低

C．Cas9蛋白作用于磷酸二酯键

D．通过CRISPR/Cas9技术敲除猪心脏的某个抗原蛋白基因，至少需要设计两个序列不同的sgRNA

2 . 下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，其中PAM序列是一个短DNA序列，单链向导RNA可引导Cas9内切酶至特定的基因位点进行切割。下列叙述正确的是（       ）

A．Cas9内切酶能将核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开

B．细菌细胞中的限制酶也能起到类似Cas9内切酶的作用

C．Cas9内切酶定点切割与向导RNA和目标DNA结合有关

D．双链DNA的断裂修复过程需要DNA连接酶的催化

3 . 单细胞生物并没有免疫系统，但是科学家发现细菌中存在消除入侵病毒的功能系统，并发明了基因编辑技术。该系统主要包含单链向导和蛋白两个部分，能特异性识别并结合特定的序列，从而引导蛋白到相应位置并剪切，最终实现对靶基因序列的编辑。下列叙述错误的是（       ）

A．蛋白通过切断磷酸二酯键对进行剪切

B．基因编辑技术本质上是对靶基因进行编辑引发染色体结构变异

C．识别序列与链存在的碱基互补配对方式为，，，

D．向导的序列越短，会导致脱靶率越高

4 . CRISPR/Cas9基因编辑技术是将编码Cas9酶和sgRNA的基因作为目的基因，构建基因表达载体后导入受体细胞，可对细胞内某个基因定点切割，引发被切割部位的随机突变（图1）。科研人员在CRISPR/Cas9编辑系统基础上开发了CBE单碱基编辑系统，该系统由三个元件构成，其中“dCas9蛋白+脱氨酶”在sgRNA的引导下，对结合区域第4-8位点的碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的不可逆编辑，不需要DNA链断裂（如图2）。请回答下列问题：

   

(1)图1中Cas9酶作用于DNA某特定部位的____键。CRISPR/Cas9编辑系统能特异性识别某段特定DNA序列的原理是依靠____与特定DNA序列进行____。
(2)CBE编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后，细胞复制____次，子代DNA中靶位点碱基对由C-G彻底替换成____，实现单碱基编辑。
(3)基因编辑可能造成非目标序列的碱基改变，称为脱靶。下图是我国科研工作者建立了一种脱靶检测技术。在小鼠受精卵分裂到2细胞时期，编辑其中1个细胞，并使用红色荧光蛋白将其标记。当小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，再利用细胞分选技术，进行全基因组测序，比较两组差异。

   

①小鼠受精卵可以从雌鼠____中采集或通过____技术获得。当小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎先用____处理，分散成单细胞再进行分选。
②图中的标记基因的作用是____。
③在该实验中，没有编辑的那个细胞发育出的细胞的作用是____。经检测，如果两种细胞之间存在基因组碱基序列上的差异，这种差异就是____引起的。与用同一品系小鼠不同受精卵进行脱靶检测相比，上述脱靶检测技术更加精准，这是因为____。

5 . 哪项技术可以用于在细胞中特异性敲除某个基因（       ）

A．PCR（聚合酶链式反应）	B．RNA干扰
C．CRISPR-Cas9	D．Southern印迹

6 . 研究人员利用最新基因编辑工具CRISPR/Cas9，成功敲除了比格犬的载脂蛋白E（APOE）基因，培育出动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。利用“苹果”腹部皮肤体细胞作为样本，建立细胞系，取其细胞核注入比格犬去核卵母细胞中，形成早期胚胎后进行胚胎移植，得到了我国首只克隆犬“龙龙”。如图为克隆犬“龙龙”诞生的流程图，回答下列问题：
   
(1)CRISPR/Cas9系统是由Cas9蛋白和sgRNA构成的RNA-蛋白复合体，其中的____负责识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目的基因进行编辑，在实践中发现该系统有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”的现象，实验发现sgRNA的序列长短影响成功率，sgRNA序列越长脱靶率越____（填“高”或“低”）。
(2)取“苹果”的皮肤细胞，并进行体细胞建系。皮肤细胞在培养过程中，首先应保证其处于____的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要一定的气体环境是____。
(3)为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射____，获得的卵母细胞应在体外培养____期。
(4)克隆本质上是一种无性繁殖，该过程的最后一道工序是胚胎移植，其实质是____。胚胎移植前，需对供、受体犬进行____处理，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境。重构胚通常需要发育到____阶段才能进行胚胎移植。

7 . 回答与生物技术有关的下列两小题：
Ⅰ.甘蓝型油菜引入我国历史较短，其遗传基础狭隘。菘蓝（别名“板蓝根”）是传统中药材，具有广谱抗病毒特性。研究人员利用甘蓝型油菜（体细胞中染色体数为38）与菘蓝（体细胞中染色体数为14）进行体细胞杂交，培育抗病毒的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系，过程如图1。

(1)甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞经__________酶处理后获得原生质体，再经__________诱导获得融合细胞。融合细胞接种到含有营养物质和__________的培养基上，经__________过程形成愈伤组织，发育形成完整的再生植株F₁。植物体细胞杂交技术依据的生物学原理有：__________。（至少答出两个）
(2)将F₁与甘蓝型油菜回交，获得BC₁，其染色体组成为__________（只用字母表示）。用BC₁与甘蓝型油菜再一次回交，得到的BC₂植株群体的染色体数目范围是_______。
(3)研究人员从BC₂筛选出7种只含有1条菘蓝染色体的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系（A、B、C、D、E、F、G）。为探究甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在抗新冠病毒（SARS-CoV-2）中的作用，研究人员用其提取物处理动物细胞，24h后感染新冠病毒，一段时间后收集病毒细胞培养液，检测病毒的含量，结果如图2。
   
①作为标准参考的GADPH蛋白表达量__________，可排除无关变量对实验结果的影响。
②结果表明：__________。
③尝试说出建立甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在育种方面的意义：__________。（答出两个方面）
Ⅱ.母源因子是初级卵母细胞在减数分裂Ⅰ前期的后段开始产生并积累的mRNA和蛋白质，其对于调控动物早期胚胎的发育十分重要。为研究不同母源因子的功能，相应母源突变体的培育显得尤为重要。
(4)母源因子由母源效应基因通过基因__________过程产生，其产生并积累的时期由于同源染色体未分离，因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。
(5)获得母源突变体的传统方法是反复交配与筛选。以母源效应基因A为例，科学家利用基因编辑技术将斑马鱼的一个A基因敲除后获得杂合子，记作（+/-）。如图1是获得母源突变体的杂交方案，请补全下图__________。

(6)传统交配筛选的方法存在耗时长、纯合的合子突变体的致死率高等缺陷。为了解决上述问题，科学家在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上进行了改进。
①sgRNA编码序列能与相应靶基因序列发生碱基互补配对。为构建含有sgRNA编码序列的重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA用__________处理，然后将其插入到经相同酶处理过的质粒上。斑马鱼的卵母细胞与精子受精前停滞在减数分裂Ⅰ前期，此时还未开始合成母源因子，在此阶段前对卵母细胞进行基因敲除可避免母源因子的积累。
②为了实现卵母细胞中基因的特异性敲除，如图2所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒后导入卵母细胞。

注：eflap—能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP—增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI一归位内切酶，可将质粒随机插入到斑马鱼的基因组中。
从理论上分析，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析3个sgRNA串联有何优势，请答出2点__________。
(7)I-SecI介导的基因插入率并不能达到100%，请根据上述研究分析如何在斑马鱼早期胚胎中筛选出突变体，并说明理由_____。

8 . 我国科学家利用基因编辑技术敲除杂交水稻中的4个基因，获得了可以发生无融合生殖（不发生雌雄配子的细胞核融合而产生种子的生殖）的水稻材料，得到了杂交稻的克隆种子，实现了杂合基因型的固定。该无融合生殖的原理过程如图所示，下列相关分析正确的是（　　）

A．图中过程①产生配子时可能发生了类似有丝分裂的过程

B．雌雄配子结合时可能发生了雄配子细胞核的退化消失

C．利用基因编辑技术敲除水稻中的4个基因属于基因突变

D．无融合生殖获得的克隆种子可稳定保持亲代的杂种优势

9 . 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（       ）

A．经基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液

B．经基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期后移植入同期发情小鼠的子宫

C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得转基因小鼠

D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎

10 . 为研究组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）基因的生物学功能，研究者以斑马鱼为研究对象，通过CRISPR/Cas9技术构建HDAC8基因缺失的突变模型（如图1所示）。

回答下列问题：
(1)据图1分析可知：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现靶向切除HDAC8基因的原理是Cas9蛋白—sgRNA复合体中sgRNA识别并与目标DNA中的靶点序列结合，其中sgRNA与靶点序列结合的碱基序列为____；Cas9蛋白作用于目标DNA的____（填化学键）使双链断裂，实现对HDAC8基因敲除。
(2)sgRNA是由体外转录形成的，其基因的上游具有____，该结构的作用是____。
(3)通过对野生型斑马鱼和实施HDAC8基因敲除的斑马鱼HDAC8进行检测，结果如图2所示（数字表示HDAC8氨基酸的数量）。研究人员认为HDAC8基因敲除成功，理由是____，功能丧失。出现图2结果的原因可能是HDAC8基因转录的mRNA中____提前出现。

(4)将敲除成功的纯合斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，F₁自由交配得F₂。将F₂不同类型的斑马鱼标记后放归到有捕食性天敌的野外水域中，一段时间后发现突变纯合子数量明显减少，而其他类型的数量几乎没变。请结合图3解释突变纯合子数量变化的原因____。