1 . CRISPR-Cas9技术是一种应用广泛的基因编辑技术，通过人工设计的sgRNA（guideRNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。科学家利用CRISPR-Cas9技术将抑癌基因△Np63a定点插入小鼠胰腺癌细胞中，以研究其在胰腺癌细胞中的作用。图1为构建的Cas9—sgRNA质粒，将其导入胰腺癌细胞并表达（图2）；携带△Np63a基因的供体质粒与断裂DNA的高度同源序列（同源臂）发生互换，从而将△Np63a基因定点插入胰腺癌细胞基因组中（如图3所示）。请回答下列问题：

   

(1)Cas9蛋白可对特定的DNA序列切割，在功能上最接近于________酶；一次切割过程中会产生__________个游离的磷酸基团；将Cas9-sgRNA质粒和供体质粒导入胰腺癌细胞的方法是_________。
(2)若已知靶序列5'-GCATCG…GGTCCC-3'，根据该靶序列设计的sgRNA中的相应序列是5'-__________-3'。若要将靶序列从目标DNA上切除下来，则需要设计________种不同的sgRNA。
(3)CRISPR-Cas9系统有时存在结合出错而出现“脱靶”现象，分析其可能原因是_________。
(4)若要检测△Np63a基因是否已导入成功，可使用__________技术。被△Np63a基因成功转化的胰腺癌细胞体外培养时，在细胞水平上可能发生的变化有________。
(5)在上述基因编辑过程中，下列核酸序列中应已知碱基序列的有_____________。

A．sgRNA识别序列	B．同源臂1
C．同源臂2	D．CMV启动子

2 . 研究人员利用最新基因编辑工具CRISPR/Cas9，成功敲除了比格犬的载脂蛋白E（APOE）基因，培育出动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。利用“苹果”腹部皮肤体细胞作为样本，建立细胞系，取其细胞核注入比格犬去核卵母细胞中，形成早期胚胎后进行胚胎移植，得到了我国首只克隆犬“龙龙”。如图为克隆犬“龙龙”诞生的流程图，回答下列问题：
   
(1)CRISPR/Cas9系统是由Cas9蛋白和sgRNA构成的RNA-蛋白复合体，其中的____负责识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目的基因进行编辑，在实践中发现该系统有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”的现象，实验发现sgRNA的序列长短影响成功率，sgRNA序列越长脱靶率越____（填“高”或“低”）。
(2)取“苹果”的皮肤细胞，并进行体细胞建系。皮肤细胞在培养过程中，首先应保证其处于____的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要一定的气体环境是____。
(3)为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射____，获得的卵母细胞应在体外培养____期。
(4)克隆本质上是一种无性繁殖，该过程的最后一道工序是胚胎移植，其实质是____。胚胎移植前，需对供、受体犬进行____处理，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境。重构胚通常需要发育到____阶段才能进行胚胎移植。

3 . “脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术， 通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元， 帮助科学家了解大脑。该技术利用 Cre/loxP 系统标记神经元。Cre/loxP 系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。
      
(1)图 1 是利用 Cre/ loxP 系统敲除基因的过程。loxP 序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。其中决定 loxP 方向的序列是________ 。当某一个 DNA片段上待敲除基因的两端存在同向 loxP 序列时， Cre 酶识别并结合到 loxP 序列的反向重复序列区。两个 loxP 序列的间隔序列被 Cre 酶定点切开， 4 个黏性末端序列交错两两连接， 其中待敲除基因两端的序列进行连接， 连接时形成的化学键是________ ， 敲除的基因片段会形成________ （填“线状”或“环状”）结构， 保留的 DNA片段中是否还存在 loxP序列？________ （填“是”或“否”）
(2)若经 Cre 酶作用使得 2 个 loxP 位点间的序列发生反转， 其原因可能是___________ 。
(3)现以小鼠为材料，利用“脑彩虹”技术研究其大脑内的神经元。研究者需先用___________ 酶处理三种荧光蛋白基因、两种 loxP 序列， 将它们与脑组织特异表达启动子 M 相连接，构建图 2 所示的基因表达载体，再用显微注射法将该基因表达载体导入小鼠的___________ 中，进而得到仅含一个图 2 所示片段的转基因小鼠， 再经过进一步操作， 获得纯合的转基因小鼠 a。
(4)图 2 所示序列的两个 loxP1 之间或两个 loxP2 之间的基因， 只会被 Cre 酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中 Cre 酶的表达受调控， 研究者将 Cre 酶基因与启动子 N（由信号分子 X 开启） 连接， 经一系列操作， 获得纯合转基因小鼠 b， 将纯合小鼠 a 和 b 杂交，得到 F₁。
①无信号分子 X 作用时， F₁脑组织和其他组织细胞的颜色分别是________ 、________ 。
②有信号分子 X 作用时， F₁出现“脑彩虹”， 请阐述机理： ________ 。

4 . CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题：
(1)Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______酶，该过程体现了酶具有______性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的___________。
(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，sgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________；解决措施是_________。
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。

注：eflap是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：____________(答出两点)。
(4)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。

①写出His基因模板链的碱基序列：5'-___________________________-3'。
②为构建融合基因并将其插入载体科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物_______(填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5'-_________-3'。

6 . CCR5是HIV入侵人体T细胞的主要辅助受体之一、有科学家为了使婴儿一出生就具有抵抗艾滋病的能力，通过基因编辑破坏了受精卵中的CCR5基因，该做法引起了民众普遍的担忧。下列各项不属于担忧依据的是（       ）

A．CCR5基因可能还参与了其他生理过程的调控

B．基因编辑技术有可能因编辑对象错误（脱靶）造成不可预知的后果

C．被编辑个体受其他疾病感染的风险可能会提高

D．该技术虽然符合人类伦理道德，但可能存在潜在的安全风险

7 . CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，SgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（       ）
   

A．Cas9蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键

B．向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸

C．CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA序列越短，脱靶率越低

D．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和不同的sgRNA进行基因编辑

8 . CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图）．利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是（       ）

   

A．Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因

B．sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构

C．基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对

D．通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组

9 . CRISPR-Cas 9广泛存在于细菌等原核生物体内，而CRISPR-Cas9基因编辑技术是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA） 引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割，如图所示。

(1)Cas 9蛋白可催化_________（填化学键名称）水解，剪切特定DNA片段。CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌等原核生物中的生理意义是______；
(2)若α链剪切点附近序列为—TCCACAATC—，则相应的识别序列为_______，sgRNA 与目标DNA结合片段中最多含有_______种核苷酸。
(3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路：_________

10 . 下图是用CRISPR/Cas9系统对某生物B基因进行基因编辑的过程，CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，SgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，Cas9蛋白的作用类似于限制酶，其机制如图所示，图中的Ⅱ片段被去除。下列说法正确的是（       ）

A．SgRNA通过与DNA分子双链互补配对引导Cas9蛋白到位

B．图中sgRNA1的碱基序列和SgRNA2的碱基序列互补

C．特异性识别DNA序列并切割特定位点功能的分子是sgRNA

D．一般sgRNA序列越短，越容易因错误结合而出现“脱靶”现象