2 . 肝纤维化与肝细胞癌的发生密切相关，肝纤维化是指肝细胞外基质的病理性沉积，沉积物中Ⅰ型胶原蛋白是主要成分。研究发现活化的人肝星状细胞会大量合成和分泌Ⅰ型胶原蛋白沉积在肝小叶的窦间隙，大量产生Ⅰ型胶原蛋白是肝星状细胞活化的标志之一。人Ⅰ型胶原蛋白由2条Ⅰ型胶原蛋白α1肽链和1条α2肽链组成，它们分别由COL1A1和COL1A2编码。本研究旨在通过基因工程技术用人COL1A1启动子序列调控增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达，在LX-2细胞（永生化的人肝星状细胞）中建立一个人肝星状细胞活化的可视化报告系统。
(1)研究过程中应将LX-2细胞置于含____________的气体条件下培养，其中O₂的作用是____________。
(2)研究人员构建了如图1所示的基因表达载体，构建过程所需要的工具酶有____________；其中Kozak序列能增强EGFP基因的表达，已知EGFP基因的α链为转录的模板链，则应将图2中EGFP基因的____________（“A”或“B”）端与Kozak序列连接，除图1中所示元件外，基因表达载体还应具备____________（至少答两点）等元件。

   

(3)使用慢病毒包装系统将基因表达载体导入LX-2细胞中，并筛选得到了荧光强度最强的细胞株（入LX-2-CE）进行扩大培养于后续研究。为验证LX-2-CE能通过EGFP表达来反映细胞表达COL1A1能力的改变，本研究选取了已知具有潜在抗肝纤维化作用的药物青蒿琥酯对LX-2-CE进行处理。实验分组中的阴性对照组为____________，阳性对照组为加10μg/L的TGF-β1诱导处理的LX-2-CE，实验组为加入不同浓度青蒿琥酯与10g/L的TGF-β1共处理的LX-2-C。实验结束后，对各组LX-2-CE进行荧光检测，并分别通过____________和____________技术检测相关基因（COL1A1和EGFP）是否转录出mRNA和翻译出蛋白质，与荧光检测结果相互印证。若实验组的荧光强度均____________（“低于”或“高于”）阳性对照组的荧光强度，说明LX-2-CE荧光强度的改变可以反应青蒿琥酯的潜在抗肝纤维化作用。实验中10μg/L的1TGF-β1的作用是____________LX-2-CE。
(4)系列实验结果表明，外源性COL1A1启动子调控的EGFP的表达能在一定程度上反映内源性COL1A1启动子调控的COL1A1的表达水平的变化。请你推测该人肝星状细胞活化的可视报告系统建立的意义是____________。

6 . 利用生物工程生产宫颈癌疫苗
人乳头瘤病毒（HPV）是一类DNA病毒，持续感染高危型HPV可能引发宫颈癌。感染HPV后，人体内发生的部分生理过程如图1所示，其中，Ⅰ~Ⅳ表示免疫细胞；L1为HPV病毒表面抗原，E6和E7皆为HPV病毒内部蛋白；p53蛋白和pRb蛋白皆为抑癌蛋白。

(1)人体感染HPV后，图1中细胞Ⅱ的功能是______。（多选）
A. 分泌免疫活性物质       B. 清除被病毒入侵的细胞I
C. 清除被病毒入侵的上皮细胞       D. 识别靶细胞抗原肽-MHC分子复合体
(2)图1中细胞Ⅲ参与的免疫应答属于______。（多选）
A. 非特异性免疫       B. 特异性免疫
C. 体液免疫       D. 细胞免疫
(3)据图1分析，长期感染高危型HPV诱发宫颈癌的原因可能是HPV的______。（多选）
A. E7蛋白降解pRb蛋白，促进上皮细胞DNA的复制
B. E7蛋白与pRb蛋白结合，促进上皮细胞由G1期进入S期
C. E6蛋白与p53蛋白结合，抑制上皮细胞DNA聚合酶的合成
D. E6蛋白激活p53蛋白，促进上皮细胞纺锤体相关蛋白的合成
注射HPV疫苗是预防宫颈癌的有效手段。制备预防型HPV疫苗的部分流程如图2所示，其中，Ⅰ~Ⅳ表示过程；kb表示1000碱基对；AbA^r为真菌类抗生素（AbA）的抗性基因；α-半乳糖苷酶基因表达的酶蛋白可将一种无色化合物（X-α-gal）水解成蓝色产物；pMD上仅在α-半乳糖苷酶基因的两端存在BamHI和XhoI的酶切位点。

(4)据图2判断，基因工程生产预防型HPV疫苗所需要的工具酶有______。（编号选填）
① BamHI                    ② MboI                           ③ XhoI                    ④ DNA连接酶
(5)据图1、2推断，基因工程制备预防型HPV疫苗的目的基因是______。（编号选填）
① L1基因                    ② E6基因                    ③ E7基因             ④ MHC
(6)图2中过程Ⅳ所用的选择培养基需在通用液体培养基的基础上添加______。（编号选填）
① 琼脂                                               ② 生长因子                            ③ 水
④ AbA                                               ⑤ X-α-gal                                 ⑥ 无机盐
(7)据图2判断，将______（蓝色/白色）菌落中的pMD-HPV分子用过程Ⅱ中的限制性内切核酸酶完全酶切后，理论上凝胶电泳上出现的条带的长度为______kb。
(8)为提高HPV疫苗对免疫系统的激活能力，据相关信息及已学知识推测，可采取的做法有______。（多选）
A. 利用定向进化技术获得新型抗原蛋白
B. 利用定点突变技术获得天然抗原蛋白
C. 避免接种期间使用免疫抑制剂类药物
D. 根据年龄、感染风险等制定接种方案

8 . 胰岛素促进因子（PDX-1）能诱导干细胞分化为胰岛β细胞，为糖尿病的治疗提供了新的思路。科研人员欲构建PDX-1基因的克隆载体用于诱导干细胞分化。回答下列问题：
(1)mRNA的提取：培养小鼠胰岛瘤细胞，待培养至贴壁80%左右时，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，经胰蛋白酶消化后加入过量新培养液，取一定量的细胞破碎离心，提取RNA。其中磷酸盐缓冲液的作用是_____，加入胰蛋白酶是为了_____，加入过量新培养基是为了_____。
(2)cDNA的合成：从_____中检索小鼠PDX-1基因的mRNA序列，设计上下游引物并在引物的_____端分别添加HindIII和BamHI限制酶切序列。以提取的RNA为模板进行逆转录，为防止RNA被水解，需要在逆转录体系中加入_____。然后进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳。
(3)克隆载体的构建：回收凝胶中目的基因片段，并进行纯化。选用的克隆载体结构如图所示，其中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。用_____酶将cDNA纯化物与该克隆载体连接形成重组DNA分子。重组的效率除了与温度、pH等外界环境因素有关，还与_____等有关。将重组DNA分子导入用_____处理过的感受态大肠杆菌中进行转化，将转化后的大肠杆菌用玻璃刮刀接种于含_____的LB固体培养基中，37℃恒温培养箱中培养24h，其中_____色菌落为阳性克隆。

(4)科研人员将含有PDX-1基因的腺病毒载体转染人的干细胞，使其分化为胰岛β细胞，该过程中_____基因得到了表达。该细胞可用于治疗由_____引起的糖尿病。