2 . 杂种不育制约了人们对籼稻与粳稻杂交后代杂种优势的利用。科研人员发现影响籼-粳杂交稻雄配子育性的染色体片段R12。
(1)R12上含有2个基因——D与J。D基因编码一种毒素，可以引发线粒体功能障碍，从而影响花粉的_______供应。J基因编码一种“解毒剂”，可将毒素包裹于自噬体中，再与_______（填细胞器）融合，进而将毒素分解。
(2)现将籼稻（含R12，染色体组成表示为MM）与粳稻（不含R12，染色体组成表示为NN）杂交，F₁产生的染色体组成是N的花粉不育，此类型花粉无D与J基因，但其细胞质中含有D基因编码的毒素。据此推测F₁（♂）与籼稻（♀）杂交子代的染色体组成为_______。
(3)为验证基因D具有编码毒素的作用，研究人员利用基因编辑技术敲除了D基因。进行基因编辑需设计与目标序列互补的向导RNA，引导核酸内切酶Cas9结合到此部位进行切割。请将下列各项排序，以呈现“证明D基因敲除导致花粉育性恢复”的研究思路：根据D基因特异性序列设计向导RNA的基因→_______→检测花粉育性，并统计子代分离比。                 
①选择D基因敲除植株     ②通过PCR扩增相关基因并测序③连接到含Cas9基因的载体中④转化至F₁愈伤组织中     
敲除D基因的F₁自交，子代中MM、MN、NN植株的比例为_______，表明D能编码一种杀死花粉的毒素。
(4)为进一步验证J蛋白的解毒作用，将J基因导入到F₁中，获得转入单个J基因的F₁。请预期F₁自交的子代中MM、MN、NN植株的比例_______。（写出所有可能的比例）
(5)依据上述研究，下列关于R12片段应用的说法，合理的是_______
a．可通过敲除该片段中的D基因，解决杂交后代花粉不育的难题
b．可将优良基因与R12片段相连，获得优良基因快速传播和纯合的新品种
c．不可利用R12片段选择性消除易感病基因，获得抗病品种

3 . 为研究果蝇K基因的功能，科研人员运用CRISPR基因编辑技术“敲除”了K基因。

(1)CRISPR系统由向导RNA和Cas9核酸酶组成，向导RNA可与DNA的一条链通过_____原则结合，Cas9酶能将与之结合的双链DNA切割，如图1所示。Cas9酶与基因工程使用的限制酶作用的差异是_____。
(2)为后续筛选K基因“敲除”的果蝇，在K基因DNA断裂位点插入红色荧光蛋白基因（RFP）需提供携带有红色荧光蛋白基因的供体质粒。
①应选用_____处理图2所示的质粒和红色荧光蛋白基因，以构建供体质粒，同时避免质粒自连。
②将Cas9酶基因、向导RNA基因和供体质RFP基因粒导入果蝇的_____中，若检测到红色荧光，则表明K基因可能被成功“敲除”，该受精卵发育成的果蝇即为F₀代果蝇。
(3)为确认K基因是否被成功“敲除”，科研人员进行了如下实验：

①科研人员用图3中的引物I、II、III对F₀代果蝇DNA进行PCR并电泳检测（大于10kb片段单次PCR无法完成扩增）。若敲除成功，则观察到的不同个体电泳条带可能有两种情况：_____或_____（长度单位：kb），出现这两种情况的原因是_____。
②近年来，科研人员又发现了一种检测基因的方法——Cas12a酶法。该酶类似Cas9能够在向导RNA的作用下，在特定位点剪切目标DNA之后，还发挥非定向切割单链DNA的功能（如图）。用该方法检测敲除是否成功并排除“脱靶”的方法是：利用_____序列设计向导RNA，取待检测细胞克隆导入_____和报告分子，观测指标是_____。

(4)为进一步研究K基因功能，科研人员做了如下表的实验，由此推测K基因的功能是_____。

	子代果蝇个数（只）
野生型♂×野生型♀	103
野生型♂×K基因“敲除”果蝇♀	109
K基因“敲除”果蝇♂×野生型♀	0

4 . 学习以下材料，回答（1）～（4）题。
世界首例生物节律紊乱体细胞克隆猴模型的构建
生物节律紊乱与睡眠障碍、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、精神类疾病等密切相关。我国科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植（SCNT）技术，成功构建了体细胞BMAL1基因（产生昼夜节律必需）敲除的生物节律紊乱猕猴，为相关疾病研究提供了新型动物模型。
CRISPR/Cas9基因编辑系统能在DNA特定位置进行切割，被切割的DNA修复时会发生基因突变而导致靶基因失活。研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对多枚猕猴受精卵的BMAL1基因进行敲除，经胚胎移植后获得多只猕猴，有5只表现出BMAL1基因突变，分别命名为A3、A4、A6、A8、A10．这些BMAL1基因敲除猴不再按24小时周期活动，夜间活动明显增多，表现出昼夜活动和睡眠紊乱、焦虑和精神分裂症等症状。其中A6个体的基因敲除最完全，睡眠紊乱症状最明显。野生型和A6的BMAL1基因部分序列如图所示。

   

第一代BMAL1基因敲除猴的不同个体表现出不同程度的节律紊乱症状。为进一步获得理想动物模型，研究团队采集A6个体的成纤维细胞，经SCNT后获得多只BMAL1基因敲除猴。实验大致分为四步。第一，在纺锤体成像显微系统下，通过压电驱动移液管快速去除卵母细胞的纺锤体一染色体复合物；第二，将成纤维细胞引入卵黄周间隙，用病毒介导成纤维细胞与去核卵母细胞融合；第三，在37℃条件下培养，使重构胚在培养基中活化、发育；第四，将325个处于早期的胚胎移植给6 5只代孕母猴，最终获得5只第二代BMAL1基因敲除猕猴模型。
基因检测结果表明，第二代的5只猕猴均具有与A6相同的BMAL1双等位基因突变，且外周血mRNA中不存在野生型BMAL1的转录产物，证明猕猴体内BMAL1基因表达缺失。它们均表现出较多的夜间运动和更严重的睡眠障碍等症状，是更为理想的动物模型。
第二代BMAL1基因敲除猕猴模型的成功构建，预示着批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代正式开启。
(1)实验中采集的卵母细胞通常在体外培养至_____期。
(2)结合资料，以下说法不合理的是_____。

A．经CRISPR/Cas9基因编辑和胚胎移植获得的第一代5只模型猴基因型相同

B．A6的BMAL1基因所在的一对同源染色体上的碱基变化完全相同

C．从A6获取的成纤维细胞在用于SCNT之前需进行细胞培养

D．利用A6的成纤维细胞进行克隆获得的多只猕猴基因型相同

(3)请利用箭头加文字的形式完善第二代BMAL1基因敲除猴的基本构建流程。_____

   

(4)与传统动物模型小鼠相比，利用猕猴进行人类疾病药物研发的优势是_____，与第一代BMAL1基因敲除猴模型相比，第二代猕猴模型用于研究生物节律紊乱及相关药物研发的优势是_____。

5 . 杂交种在产量等方面常优于双亲，玉米生产主要依靠种植杂交种满足人们的需求。
(1)玉米是雌雄同株的植物，需要进行繁琐的________处理，才能获得杂交种。研究者通过人工选育玉米雄性不育系，以简化制种程序，但由于其无法通过________继续保持雄性不育性状，需与携带雄性不育基因的可育品系（保持系）进行杂交，以获得雄性不育系，但该操作方法相对复杂。
(2)为获得更优的保持系以简化上述制种方法，研究者设计了基因编辑器，实现对M基因（玉米内源雄性育性基因）定点编辑。同时构建了表达载体G（图1），ZMAA是玉米_______（花粉/子房）特异性启动子驱动的淀粉酶基因，可阻断能量代谢，进而导致雄性不育。MC只能通过________配子传递给子代，原因是______。

(3)将基因编辑器与表达载体G共转化至玉米未成熟胚中，通过筛选基因组成为________（填选项）的植株作为保持系，并通过自交仅获得雄性不育系以及保持系。
A．MmG⁺G^-             B．mmG⁺G^-             C．mmG⁺G⁺             D．MmG⁺G^-
（G⁺表示具有MC、ZMAA、DsRed基因，G^-表示不具有上述三种基因）
请用遗传图解描述制种过程。______

(4)研究者通过观察_________以分拣雄性不育系和保持系种子，雄性不育系种子用于杂交种制种生产，保持系种子用于下一年生产所需保持系和不育系的繁殖，如此反复，形成高效的杂交种制种生产技术。

6 . 非霍奇金淋巴瘤是一种原发于淋巴组织的血液系统恶性肿瘤，其细胞表面高表达CD19蛋白。CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法是利用基因工程的方法使T细胞表面表达能够靶向特定抗原的受体（CAR），改造后的T细胞被称为CAR-T，可以识别并攻击带有特定抗原的肿瘤细胞，同时激活机体自身免疫从而达到抗肿瘤的效果。请回答下列问题：
(1)目前制备CAR-T细胞大多是采用慢病毒感染的方式使T细胞表达CAR。
①获取CAR基因（实质为抗CD19蛋白的抗体基因）：将抗CD19蛋白的抗体基因作为PCR反应的模板，并依据_____设计一对特异性引物来扩增该基因。
②构建基因表达载体：图1为所用载体示意图，表格为限制酶的识别序列及切割位点。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的_____端分别引入
_____两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用_____（选填“E。coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
③将目的基因导入受体细胞：将重组质粒通过_____技术导入到T细胞。
④重组质粒的筛选与鉴定：将转化后的T细胞置于含_____的培养基上进行培养，进一步通过流式细胞术验证CAR-T细胞的构建是否成功。


(2)采用病毒作为递送载体存在随机插入的安全隐患，CRISPR/Cas9技术作为第三代基因编辑工具（图2），sgRNA可引导Cas9蛋白在特定位点进行切割来完成基因的编辑。科学家利用该技术制备的CAR-T细胞，在非霍奇金淋巴瘤临床前的治疗中取得理想效果。其操作原理如图3所示。
①sgRNA能与靶基因特异性识别、结合的原理是_____，基因编辑工具中对基因进行剪切的是_____。
②肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白和T细胞表面的PD-1受体结合，发出免疫抑制信号，实现免疫逃逸。该研究团队利用CRISPR/Cas9技术切割T细胞中PD-1基因的同时导入靶向PD-1基因的同源重组序列，利用同源重组修复的原理将_____重组在PD-1基因内部，制备了非病毒定点整合的CAR-T细胞，如图3。
③综合上述信息分析，与慢病毒制备的CAR-T细胞相比，该方案制备的CAR-T细胞在非霍奇金淋巴瘤的治疗中的优点有：可以_____插入抗CD19蛋白的抗体基因，降低随机插入的安全隐患，提高CAR-T细胞的安全性；可以使PD-1基因突变，降低肿瘤细胞____　的可能性，提高CAR-T细胞的有效性。

7 . CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，在肿瘤治疗领域展现出极大的应用前景。
(1)该技术的原理是由向导RNA按照__________原则与目标DNA结合，引导核酸内切酶Cas9对目标DNA进行切制和定向改变（图1）。

(2)将Cas9和向导RNA基因导入人体细胞，对突变的__________基因进行修复是肿瘤治疗的思路。但Cas9基因太大，超过载体的装载能力，以及缺乏可控性是临床应用的难点。
(3)科研人员将Cas9拆成两个肽段：Cas9N和Cas9C，分开时缺乏核酸酶活性，利用两种能自发结合的蛋白Coh2和DocS，实现Cas9两个肽段的拼接，获得有活性的Cas9。基于以上原理构建转基因小鼠，图2所示表达载体①处可选择__________，②处可选择_____。（选填字母编号）
A.Cas9N基因       B．Cas9C基因C．完整的Cas9基因D．Coh2和DocS融合基因E．DocS和Cas9C的融合基因F．Coh2和Cas9N的融合基因

(4)细菌中的S蛋白能被远红光激活，释放信号；放线菌中的D蛋白，接收到该信号后能结合DNA。科研人员将S蛋白基因、D蛋白和转录激活因子（能结合上述启动子1并激活转录）融合基因与基因编辑系统一同导入小鼠（启动子2不受诱导，持续转录）。结合（3）补充“光启”基因编辑工作系统（FAST）原理：_____

(5)科研人员将FAST转入肿瘤模型小鼠体内，实验分组如图3所示（远红光照射方法为连续7天每天对肿瘤部位进行4小时照射）。结合上述研究说明FAST比普通CRISPR/Cas9技术的优越之处。

10 . 为培育香型抗稻瘟病水稻，研究者利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术（机理如图1），将含有Cas9和gRNA基因的表达载体（如图2）导入水稻，定向敲除香味抑制基因Badh2、感稻瘟病基因Pi21。


(1)CRISPR-Cas9系统能精准敲除靶基因，其作用机理是gRNA与靶基因进行____；Cas9蛋白可催化____（填化学键名称）水解，剪切特定DNA片段，被切割的DNA修复时会引起____（变异类型），导致基因失活。
(2)研究者用农杆菌转化法将CRISPR-Cas9表达载体导入水稻愈伤组织。为筛选成功导入表达载体的水稻愈伤组织，培养基中需加入____。
(3)为研究水稻的靶点突变情况，提取____，并设计____，进行PCR扩增并测序分析，获得Pi21-Badh2双基因突变杂合株系。
(4)将Pi21-Badh2双基因突变杂合株系____，以获得不含转基因成分（无T-DNA）的纯合突变植株。
①子代中，Pi21-Badh2双基因突变纯合子的概率为1/16，则两基因的位置关系为：____。
②对纯合突变植株利用Cas9的引物进行扩增，结果如下图，应选取植株____对突变基因做进一步的功能鉴定。从生物安全的角度，阐明选择的理由：____。