3 . CRISPR/Cas9基因编辑技术是将编码Cas9酶和sgRNA的基因作为目的基因，构建基因表达载体后导入受体细胞，可对细胞内某个基因定点切割，引发被切割部位的随机突变（图1）。科研人员在CRISPR/Cas9编辑系统基础上开发了CBE单碱基编辑系统，该系统由三个元件构成，其中“dCas9蛋白+脱氨酶”在sgRNA的引导下，对结合区域第4-8位点的碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的不可逆编辑，不需要DNA链断裂（如图2）。请回答下列问题：

   

(1)图1中Cas9酶作用于DNA某特定部位的____键。CRISPR/Cas9编辑系统能特异性识别某段特定DNA序列的原理是依靠____与特定DNA序列进行____。
(2)CBE编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后，细胞复制____次，子代DNA中靶位点碱基对由C-G彻底替换成____，实现单碱基编辑。
(3)基因编辑可能造成非目标序列的碱基改变，称为脱靶。下图是我国科研工作者建立了一种脱靶检测技术。在小鼠受精卵分裂到2细胞时期，编辑其中1个细胞，并使用红色荧光蛋白将其标记。当小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，再利用细胞分选技术，进行全基因组测序，比较两组差异。

   

①小鼠受精卵可以从雌鼠____中采集或通过____技术获得。当小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎先用____处理，分散成单细胞再进行分选。
②图中的标记基因的作用是____。
③在该实验中，没有编辑的那个细胞发育出的细胞的作用是____。经检测，如果两种细胞之间存在基因组碱基序列上的差异，这种差异就是____引起的。与用同一品系小鼠不同受精卵进行脱靶检测相比，上述脱靶检测技术更加精准，这是因为____。

4 . 单细胞生物并没有免疫系统，但是科学家发现细菌中存在消除入侵病毒的功能系统，并发明了基因编辑技术。该系统主要包含单链向导和蛋白两个部分，能特异性识别并结合特定的序列，从而引导蛋白到相应位置并剪切，最终实现对靶基因序列的编辑。下列叙述错误的是（       ）

A．蛋白通过切断磷酸二酯键对进行剪切

B．基因编辑技术本质上是对靶基因进行编辑引发染色体结构变异

C．识别序列与链存在的碱基互补配对方式为，，，

D．向导的序列越短，会导致脱靶率越高

5 . 回答与生物技术有关的下列两小题：
Ⅰ.甘蓝型油菜引入我国历史较短，其遗传基础狭隘。菘蓝（别名“板蓝根”）是传统中药材，具有广谱抗病毒特性。研究人员利用甘蓝型油菜（体细胞中染色体数为38）与菘蓝（体细胞中染色体数为14）进行体细胞杂交，培育抗病毒的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系，过程如图1。

(1)甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞经__________酶处理后获得原生质体，再经__________诱导获得融合细胞。融合细胞接种到含有营养物质和__________的培养基上，经__________过程形成愈伤组织，发育形成完整的再生植株F₁。植物体细胞杂交技术依据的生物学原理有：__________。（至少答出两个）
(2)将F₁与甘蓝型油菜回交，获得BC₁，其染色体组成为__________（只用字母表示）。用BC₁与甘蓝型油菜再一次回交，得到的BC₂植株群体的染色体数目范围是_______。
(3)研究人员从BC₂筛选出7种只含有1条菘蓝染色体的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系（A、B、C、D、E、F、G）。为探究甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在抗新冠病毒（SARS-CoV-2）中的作用，研究人员用其提取物处理动物细胞，24h后感染新冠病毒，一段时间后收集病毒细胞培养液，检测病毒的含量，结果如图2。

   

①作为标准参考的GADPH蛋白表达量__________，可排除无关变量对实验结果的影响。
②结果表明：__________。
③尝试说出建立甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在育种方面的意义：__________。（答出两个方面）
Ⅱ.母源因子是初级卵母细胞在减数分裂Ⅰ前期的后段开始产生并积累的mRNA和蛋白质，其对于调控动物早期胚胎的发育十分重要。为研究不同母源因子的功能，相应母源突变体的培育显得尤为重要。
(4)母源因子由母源效应基因通过基因__________过程产生，其产生并积累的时期由于同源染色体未分离，因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。
(5)获得母源突变体的传统方法是反复交配与筛选。以母源效应基因A为例，科学家利用基因编辑技术将斑马鱼的一个A基因敲除后获得杂合子，记作（+/-）。如图1是获得母源突变体的杂交方案，请补全下图__________。

(6)传统交配筛选的方法存在耗时长、纯合的合子突变体的致死率高等缺陷。为了解决上述问题，科学家在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上进行了改进。
①sgRNA编码序列能与相应靶基因序列发生碱基互补配对。为构建含有sgRNA编码序列的重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA用__________处理，然后将其插入到经相同酶处理过的质粒上。斑马鱼的卵母细胞与精子受精前停滞在减数分裂Ⅰ前期，此时还未开始合成母源因子，在此阶段前对卵母细胞进行基因敲除可避免母源因子的积累。
②为了实现卵母细胞中基因的特异性敲除，如图2所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒后导入卵母细胞。

注：eflap—能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP—增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI一归位内切酶，可将质粒随机插入到斑马鱼的基因组中。
从理论上分析，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析3个sgRNA串联有何优势，请答出2点__________。
(7)I-SecI介导的基因插入率并不能达到100%，请根据上述研究分析如何在斑马鱼早期胚胎中筛选出突变体，并说明理由_____。

6 . 为研究组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）基因的生物学功能，研究者以斑马鱼为研究对象，通过CRISPR/Cas9技术构建HDAC8基因缺失的突变模型（如图1所示）。

回答下列问题：
(1)据图1分析可知：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现靶向切除HDAC8基因的原理是Cas9蛋白—sgRNA复合体中sgRNA识别并与目标DNA中的靶点序列结合，其中sgRNA与靶点序列结合的碱基序列为____；Cas9蛋白作用于目标DNA的____（填化学键）使双链断裂，实现对HDAC8基因敲除。
(2)sgRNA是由体外转录形成的，其基因的上游具有____，该结构的作用是____。
(3)通过对野生型斑马鱼和实施HDAC8基因敲除的斑马鱼HDAC8进行检测，结果如图2所示（数字表示HDAC8氨基酸的数量）。研究人员认为HDAC8基因敲除成功，理由是____，功能丧失。出现图2结果的原因可能是HDAC8基因转录的mRNA中____提前出现。

(4)将敲除成功的纯合斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，F₁自由交配得F₂。将F₂不同类型的斑马鱼标记后放归到有捕食性天敌的野外水域中，一段时间后发现突变纯合子数量明显减少，而其他类型的数量几乎没变。请结合图3解释突变纯合子数量变化的原因____。

7 . “脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术， 通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元， 帮助科学家了解大脑。该技术利用 Cre/loxP 系统标记神经元。Cre/loxP 系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。
      
(1)图 1 是利用 Cre/ loxP 系统敲除基因的过程。loxP 序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。其中决定 loxP 方向的序列是________ 。当某一个 DNA片段上待敲除基因的两端存在同向 loxP 序列时， Cre 酶识别并结合到 loxP 序列的反向重复序列区。两个 loxP 序列的间隔序列被 Cre 酶定点切开， 4 个黏性末端序列交错两两连接， 其中待敲除基因两端的序列进行连接， 连接时形成的化学键是________ ， 敲除的基因片段会形成________ （填“线状”或“环状”）结构， 保留的 DNA片段中是否还存在 loxP序列？________ （填“是”或“否”）
(2)若经 Cre 酶作用使得 2 个 loxP 位点间的序列发生反转， 其原因可能是___________ 。
(3)现以小鼠为材料，利用“脑彩虹”技术研究其大脑内的神经元。研究者需先用___________ 酶处理三种荧光蛋白基因、两种 loxP 序列， 将它们与脑组织特异表达启动子 M 相连接，构建图 2 所示的基因表达载体，再用显微注射法将该基因表达载体导入小鼠的___________ 中，进而得到仅含一个图 2 所示片段的转基因小鼠， 再经过进一步操作， 获得纯合的转基因小鼠 a。
(4)图 2 所示序列的两个 loxP1 之间或两个 loxP2 之间的基因， 只会被 Cre 酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中 Cre 酶的表达受调控， 研究者将 Cre 酶基因与启动子 N（由信号分子 X 开启） 连接， 经一系列操作， 获得纯合转基因小鼠 b， 将纯合小鼠 a 和 b 杂交，得到 F₁。
①无信号分子 X 作用时， F₁脑组织和其他组织细胞的颜色分别是________ 、________ 。
②有信号分子 X 作用时， F₁出现“脑彩虹”， 请阐述机理： ________ 。

9 . CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题：
(1)Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______酶，该过程体现了酶具有______性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的___________。
(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，sgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________；解决措施是_________。
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。

注：eflap是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：____________(答出两点)。
(4)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。

①写出His基因模板链的碱基序列：5'-___________________________-3'。
②为构建融合基因并将其插入载体科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物_______(填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5'-_________-3'。

10 . 我国科学家首次成功在猪胚胎中培育出了含有人类细胞的肾脏。科学家首先利用基因编辑技术培育出肾脏缺陷的猪胚胎，然后将多个人源诱导多能干细胞（iPS细胞）注射入早期胚胎中构建嵌合胚胎，培养一段时间后，胚胎被植入代孕母猪获得嵌合猪胎，最终培育拥有人细胞且功能正常的肾脏。下列有关叙述正确的是（       ）

A．iPS，细胞在理论上可发育成任何一种组织器官

B．移植处于原肠胚期的胚胎可提高移植成功率

C．常通过饲喂含性激素的饲料以促进母猪超数排卵

D．在嵌合猪胎的组织细胞内含有人和猪的染色体