5 . 生物学遗传实验以遗传学知识为基础，所得实验结论可以在生产、生活中进行实践和应用。生物学遗传实验常常研究易于区分的遗传性状，研究过程可能为杂交、测交、自交以及通过现代生物技术进行基因编辑等。
【实验一】了解不同花色的观赏向日葵杂交后代主要观赏性状的遗传规律
研究人员以GW和GY分别为父本和母本进行正反交。分别从F₁中挑选优良单株，同一单株内不同花朵间相互传粉，构建F₂花色分离群体。

	代码	样本量	主要特点
杂交亲本	GW	1	舌状花为白色，柱头为绿色
	GY	1	舌状花为黄色，柱头为紫色
F1	GW×GY	1	舌状花为黄色，柱头为紫色
	GY×GW	1	舌状花为黄色，柱头为紫色
F2	WY	182	花色分离
	YW	144	花色分离

【实验二】探究敲除SlMAPK4基因对番茄果实抗冻性的影响科研人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现对基因组特定位点的靶向编辑（工作原理如图所示），其中Cas9蛋白由Cas9基因指导合成，sgRNA是单链RNA。根据研究人员的实验研究，回答下列问题：

(1)研究发现，向日葵舌状花花色由三对独立遗传的等位基因控制，其中基因Y控制色素的合成，基因y无控制色素合成的功能；基因D和基因H对黄色有积累效应（每个显性基因对颜色深度增加的效果相同），基因型为Y_ddhh的个体的舌状花表现为乳白色。在F₂中，白色舌状花个体占总数的1/4，乳白色舌状花个体占总数的3/64。由以上信息可推知，F₁的基因型为_________；F₂中与F₁的舌状花花色相同个体的比例为_________，基因型有__________种。
(2)据图分析，CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，实验发现sgRNA的序列长短影响成功率，越短脱靶率越___________（填“高”或“低”）。
(3)Cas9蛋白在功能上属于__________酶，切割的是DNA中的__________键。
(4)已知SlMAPK4基因编辑载体上有潮霉素抗性基因（HPT），且野生植株不含有HPT基因。请写出通过PCR技术筛选SlMAPK4基因被敲除的番茄的实验思路：__________。

6 . 杂交种在产量等方面常优于双亲，玉米生产主要依靠种植杂交种满足人们的需求。
(1)玉米是雌雄同株的植物，需要进行繁琐的________处理，才能获得杂交种。研究者通过人工选育玉米雄性不育系，以简化制种程序，但由于其无法通过________继续保持雄性不育性状，需与携带雄性不育基因的可育品系（保持系）进行杂交，以获得雄性不育系，但该操作方法相对复杂。
(2)为获得更优的保持系以简化上述制种方法，研究者设计了基因编辑器，实现对M基因（玉米内源雄性育性基因）定点编辑。同时构建了表达载体G（图1），ZMAA是玉米_______（花粉/子房）特异性启动子驱动的淀粉酶基因，可阻断能量代谢，进而导致雄性不育。MC只能通过________配子传递给子代，原因是______。

(3)将基因编辑器与表达载体G共转化至玉米未成熟胚中，通过筛选基因组成为________（填选项）的植株作为保持系，并通过自交仅获得雄性不育系以及保持系。
A．MmG⁺G^-             B．mmG⁺G^-             C．mmG⁺G⁺             D．MmG⁺G^-
（G⁺表示具有MC、ZMAA、DsRed基因，G^-表示不具有上述三种基因）
请用遗传图解描述制种过程。______

(4)研究者通过观察_________以分拣雄性不育系和保持系种子，雄性不育系种子用于杂交种制种生产，保持系种子用于下一年生产所需保持系和不育系的繁殖，如此反复，形成高效的杂交种制种生产技术。

7 . CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3δ-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2％的致病突变。

(1)研究发现、Cas9切口酶只能对DNA的单链剪切，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过________________次DNA复制可以完成修复。
(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。研究发现，sgRNA会识别与之匹配的其它区域，导致sgRNA脱靶，试分析其原因是___________________，对此，你的解决措施是_________________________。
(3)为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。

①写出His的基因编码链的碱基序列5'____________________3'。
②为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物________________________（填“A”或“B”）的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5'__________________3'。

10 . 非霍奇金淋巴瘤是一种原发于淋巴组织的血液系统恶性肿瘤，其细胞表面高表达CD19蛋白。CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法是利用基因工程的方法使T细胞表面表达能够靶向特定抗原的受体（CAR），改造后的T细胞被称为CAR-T，可以识别并攻击带有特定抗原的肿瘤细胞，同时激活机体自身免疫从而达到抗肿瘤的效果。请回答下列问题：
(1)目前制备CAR-T细胞大多是采用慢病毒感染的方式使T细胞表达CAR。
①获取CAR基因（实质为抗CD19蛋白的抗体基因）：将抗CD19蛋白的抗体基因作为PCR反应的模板，并依据_____设计一对特异性引物来扩增该基因。
②构建基因表达载体：图1为所用载体示意图，表格为限制酶的识别序列及切割位点。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的_____端分别引入
_____两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用_____（选填“E。coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
③将目的基因导入受体细胞：将重组质粒通过_____技术导入到T细胞。
④重组质粒的筛选与鉴定：将转化后的T细胞置于含_____的培养基上进行培养，进一步通过流式细胞术验证CAR-T细胞的构建是否成功。


(2)采用病毒作为递送载体存在随机插入的安全隐患，CRISPR/Cas9技术作为第三代基因编辑工具（图2），sgRNA可引导Cas9蛋白在特定位点进行切割来完成基因的编辑。科学家利用该技术制备的CAR-T细胞，在非霍奇金淋巴瘤临床前的治疗中取得理想效果。其操作原理如图3所示。
①sgRNA能与靶基因特异性识别、结合的原理是_____，基因编辑工具中对基因进行剪切的是_____。
②肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白和T细胞表面的PD-1受体结合，发出免疫抑制信号，实现免疫逃逸。该研究团队利用CRISPR/Cas9技术切割T细胞中PD-1基因的同时导入靶向PD-1基因的同源重组序列，利用同源重组修复的原理将_____重组在PD-1基因内部，制备了非病毒定点整合的CAR-T细胞，如图3。
③综合上述信息分析，与慢病毒制备的CAR-T细胞相比，该方案制备的CAR-T细胞在非霍奇金淋巴瘤的治疗中的优点有：可以_____插入抗CD19蛋白的抗体基因，降低随机插入的安全隐患，提高CAR-T细胞的安全性；可以使PD-1基因突变，降低肿瘤细胞____　的可能性，提高CAR-T细胞的有效性。