3 . 为研究组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）基因的生物学功能，研究者以斑马鱼为研究对象，通过CRISPR/Cas9技术构建HDAC8基因缺失的突变模型（如图1所示）。

回答下列问题：
(1)据图1分析可知：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现靶向切除HDAC8基因的原理是Cas9蛋白—sgRNA复合体中sgRNA识别并与目标DNA中的靶点序列结合，其中sgRNA与靶点序列结合的碱基序列为____；Cas9蛋白作用于目标DNA的____（填化学键）使双链断裂，实现对HDAC8基因敲除。
(2)sgRNA是由体外转录形成的，其基因的上游具有____，该结构的作用是____。
(3)通过对野生型斑马鱼和实施HDAC8基因敲除的斑马鱼HDAC8进行检测，结果如图2所示（数字表示HDAC8氨基酸的数量）。研究人员认为HDAC8基因敲除成功，理由是____，功能丧失。出现图2结果的原因可能是HDAC8基因转录的mRNA中____提前出现。

(4)将敲除成功的纯合斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，F₁自由交配得F₂。将F₂不同类型的斑马鱼标记后放归到有捕食性天敌的野外水域中，一段时间后发现突变纯合子数量明显减少，而其他类型的数量几乎没变。请结合图3解释突变纯合子数量变化的原因____。

4 . 研究人员利用最新基因编辑工具CRISPR/Cas9，成功敲除了比格犬的载脂蛋白E（APOE）基因，培育出动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。利用“苹果”腹部皮肤体细胞作为样本，建立细胞系，取其细胞核注入比格犬去核卵母细胞中，形成早期胚胎后进行胚胎移植，得到了我国首只克隆犬“龙龙”。如图为克隆犬“龙龙”诞生的流程图，回答下列问题：

   

(1)CRISPR/Cas9系统是由Cas9蛋白和sgRNA构成的RNA-蛋白复合体，其中的_________负责识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目的基因进行编辑，在实践中发现该系统有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”的现象，实验发现sgRNA的序列长短影响成功率，sgRNA序列越长脱靶率越_____________（填“高”或“低”）。
(2)取“苹果”的皮肤细胞，并进行体细胞建系。皮肤细胞在培养过程中，首先应保证其处于______________的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要一定的气体环境是____________。
(3)为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射_______________，获得的卵母细胞应在体外培养到_______________期。在对卵母细胞去核时，可采用的方法有________________________（至少答出两种）。
(4)克隆本质上是一种无性繁殖，该过程的最后一道工序是胚胎移植，其实质是________________。胚胎移植前，需对供、受体犬进行_____________处理，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境。重构胚通常需要发育到_____________阶段才能进行胚胎移植。

5 . CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到 CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas系统的组成如下图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成）已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。回答下列有关问题：

(1)CRISPR-Cas系统的形成是细菌与病毒_____________的结果，在CRISPR-Cas系统中，前导区作为启动子，是______________识别和结合的部位，能驱动__________________基因的表达过程。
(2)CRISPR—Cas系统中，间隔区应是_______，该系统在细菌中的作用是____________。
(3)CRISPR—Cas9基因编辑技术取代早期基因工程的原因是____________________，根据其组成成分推测其工作的原理并简要叙述_______________。

6 . CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题：
(1)Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______酶，该过程体现了酶具有______性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的___________。
(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，sgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________；解决措施是_________。
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。

注：eflap是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：____________(答出两点)。
(4)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。

①写出His基因模板链的碱基序列：5'-___________________________-3'。
②为构建融合基因并将其插入载体科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物_______(填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5'-_________-3'。

8 . CRISPR/Cas9系统是一种基因组编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图），利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是（　　）

   

A．Cas9蛋白能切割目的基因的磷酸二酯键，使DNA双链断裂

B．对不同的目的基因进行编辑时可能使用相同的Cas9蛋白和sgRNA

C．基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对

D．通过基因组编辑技术引起的变异属于基因重组

9 . 党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯块基富含淀粉，而且其中的维生素是所有粮食中最全的，因此我国科学家对马铃薯这种重要粮食作物开展了大量研究。
(1)马铃薯因为自交不亲和，所以只能进行无性繁殖，我国科学家用基因编辑技术定点敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因获得了二倍体自交系的马铃薯。
①普通（非转基因）马铃薯不能自交的根本原因是____________________。
②为敲除自交不亲和基因，研究者采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，如图所示：

该技术利用一段与靶序列互补的向导RNA引导Cas9蛋白对特异靶向DNA进行识别和定点敲除自交不亲和基因，其中的Cas9蛋白相当于______酶，若要将自交不亲和基因从目标DNA上切除下来，需要设计______种不同的向导RNA。若靶序列为5'-AGCAT……GTACCT-3'，则设计的向导RNA中相应的序列应为_____________。
(2)MAP30蛋白是一种能使Ⅰ型核酸核糖体失活的蛋白质，实验表明MAP30蛋白具有抗pvx病毒功能，为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队利用农杆菌转化法将MAP30基因导入马铃薯细胞内，如图所示：

①选择Ti质粒做载体的原因是___________，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择____识别切割质粒，再用__________连接。
②个体水平上，可通过__________的方法检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，具体做法是_________。

10 . 我国科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除B猴成纤维细胞中的生物节律核心基因BMAL1，并将其与去核的卵母细胞融合，发育形成的早期胚胎植入代孕雌猴，共获得5只生物节律紊乱的克隆猴，过程如下图所示。回答下列问题：

(1)需将A猴卵母细胞体外培养至___期，并通过___进行去核处理，去核的目的是___。这些克隆猴的遗传物质不与B猴的100%相同的原因是___。
(2)CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白组成，其中sgRNA与靶DNA上某序列发生局部互补结合时，Cas9蛋白就可以像“剪刀”一样切断此处的DNA序列。CRISPR/Cas9基因编辑系统在功能上与___酶相似，其与作用的位点之间的结合具有___性。
(3)胚胎移植前，应进行同期发情处理，使供、受体生殖器官的生理变化保持___。胚胎移植的实质是___。