1 . CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，可用于基因敲除、定向基因突变和插入外源DNA分子。CRISPR具有靶向特异性，这是由两部分决定的，一部分是向导RNA和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白复合体和一个短DNA序列（PAM序列），序列通常在靶DNA的3'末端作用。Cas9内切酶是一种RNA引导的内切核酸酶，用于通过产生序列特异性双链断裂进行基因组编辑，向导RNA则作用于体内一种称为RNA编辑的后转录修饰过程中。下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，回答下列问题：
   
(1)CRISPR是在细菌DNA中发现的一些重复序列，外来病毒DNA往往会被整合到这段序列附近并转录出向导RNA以引导Cas9内切酶切割病毒DNA。细菌细胞中的________也能起到类似Cas9内切酶的作用，使脱氧核苷酸之间的________断开。Cas内切酶________（填“会”或“不会”）切割细菌自身DNA，原因是________。
(2)在对目的细胞进行基因编辑时，需要构建含Cas9蛋白基因和设计好的向导RNA基因的________并导入受体细胞内，使其在细胞中表达出Cas9蛋白和向导RNA，并进入细胞核发挥作用。研究发现，即便向导RNA与目的序列完全互补，在PAM序列突变的情况下也无法引导Cas9内切酶，结合上图推测PAM序列的作用是________。
(3)真核细胞的DNA被切割后，会发生修复连接，便有可能实现连入供体DNA分子，也可能不会连入。若要利用CRISPR/Cas9技术敲除实验动物某个致病基因获得正常细胞，试提出操作思路：________。

3 . CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，对该研究有突出贡献的科学家被授予2020年诺贝尔化学奖。其原理是由一条单链向导RNA（SgRNA）引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，从而达到基因定点敲除、敲入、突变的目的。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割（如图所示）。

（1）CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9借助向导RNA对目标DNA分子进行精准定位，依赖于_______；Cas9蛋白能对目标位点进行准确切割，是因为_____________，由此可见，Cas9在功能上属于_______酶。
（2）在使用Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和__________（填“相同”或“不同”）的向导RNA进行基因编辑。在设计向导RNA识别序列时，若目标DNA的а链切点附近序列为…GAATCTCCA…，则向导RNA上识别序列为_______。
（3）已知玉米中赖氨酸含量较低，原因是与赖氨酸合成过程中的两个关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度影响较大。当赖氨酸浓度达到一定量时就影响这两种酶的活性，从而使赖氨酸含量很难提高，不能满足需求。现使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶基因进行改造，首先需要构建由启动子、____________（目的基因）、标记基因、终止子等组成的基因表达载体，然后使用________法导入玉米细胞，完成转化后CRISPR/Cas9系统可在玉米体细胞中特定的基因位点改写遗传信息，再经______技术培育成赖氨酸高产的玉米植株。

4 . 阅读以下材料，回答（1）〜（5）。
基因魔剪：CRISPR/Cas系统
要揭示生命的运作原理，常需要对基因进行编辑。在过去，这一步异常艰难。但随着CRISPR/Cas技术的出现，科学家已能在极短时间内就更改生命密码。
CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因描入到指定位点。
通过在Cas9基因中引入突变，获得了只有切割一条链活性的nCas9。将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，科学家开发出了单碱基编辑技术（图2)，能够对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C→T(G→A)或A→G(T→C)的碱基替换。

对CRISPR/Cas系统的不断改造，使其在基因编辑外，还可用于激活或抑制基因的转录等。虽然目前CRISPR/Cas技术还存在一些不足，如脱靶问题等，但作为一种革命性的技术，其应用前景广阔。
（1）利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，需构建含gRNA基因和Cas基因的___________，并导入受体细胞。gRNA依据___________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割。
（2）有些遗传病是由于基因中一个碱基对的改变引起的，如果要修正此基因突变，图示的三种途径中，哪种更为合适？__________请判断并说明理由__________。
（3）如果要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从基因组序列中删除，设计gRNA的思路是___________。
（4）将CRISPR/Cas9技术用于抑制基因转录时（不改变基因结构），需对CRISPR/Cas9系统进行改造和设计，请写出基本思路__________。。
（5）将CRISPR/Cas技术应用于人类基因的编辑时，特别要注意___________方面的问题。

5 . 下图是采用CRISPR技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的位点进行切割，下列叙述正确的是（       ）

A．根据破坏B基因后生物体的功能变化，可推测B基因的功能

B．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA

C．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2碱基序列相同或互补

D．可利用此技术编辑生殖细胞相关基因以期生育出免疫艾滋病的婴儿

6 . CCR5是人体的正常基因，其编码的细胞膜CCR5蛋白是HIV－Ⅰ(人类免疫缺陷病毒Ⅰ型)感染的“入口”。有学者用“CRISPR/Cas9”技术对该基因进行定点编辑后植入志愿者体内，诞生了两位婴儿。这就是学术界和社会伦理界引起激烈争论的“基因编辑婴儿”事件请分析回答：

(1)将Cas9蛋白和向导RNA序列注入受精卵的方法称为________。据图推测，“CRISPR/Cas9”技术中，首先由________引导定位至目标DNA序列，然后由Cas9蛋白将DNA切断。这两种物质的作用结果类似于基因工程中________的作用。基因编辑过程中可能会产生“脱靶”(对CCR5基因以外的其他基因进行了编辑)现象，最可能的原因是________________________________________________________________________。
(2)细胞对被切断的DNA进行重新连接前大都会随机切掉或增加几个碱基对，此过程导致的变异属于________。胚胎2的两个变异CCR5基因编码的蛋白质中，氨基酸数目都可能减少，原因是____________________________。变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上，从而实现了________________________________________________________________________。
(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种精准改变目标DNA序列的技术。下列现代生物科技中与该技术最接近的是________。
A.转基因技术　　　B.蛋白质工程　　　C.细胞核移植　　　D.胚胎工程
(4)现今基因编辑技术门槛低，很多人在实验室里都可以做，如果不及时制止，就有泛滥的可能性。基因编辑婴儿事件，在社会上引起了激烈的争论，从科研工作者应具备的科学道德、科学精神来思考，你应持有的正确观点是________________________________________________________________________。

7 . 下图1是获取用于构建基因表达载体的含人生长激素基因的DNA片段(DNA复制子链延伸方向是5′→3′，转录方向为左→右)示意图，图2是所用质粒示意图，其上的Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^t表示四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列和酶切位点如下表。请据图回答：

限制酶识别序列和酶切位点表

限制酶	HindⅢ	BamHⅠ	PstⅠ	EcoRⅠ	SmaⅠ	BglⅡ
识别序列(5′→3′)	A↓AGCTT	G↓GATCC	C↓TGCAG	G↓AATTC	CCC↓GGG	A↓GATCT

(1) ①过程催化形成磷酸二酯键的酶有____________________，合成的人生长激素基因中________(选填“有”或“无”)与终止密码子相应的碱基序列。
(2) 引物1由5′→3′的碱基序列为________________________，引物2应含有限制酶________的识别序列；从图1的过程②开始进行PCR扩增，第六次循环结束时，图中用于构建基因表达载体的DNA片段所占比例是________。
(3) 在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成________种环状DNA。

(4) 2018年11月基因编辑婴儿事件震惊了世界，舆论一片哗然，某科研团队利用“CRISPR/Cas9”技术将受精卵中的艾滋病病毒受体基因CCR5进行修改，拟培育出具有艾滋病免疫能力的基因编辑婴儿。下图3为向导RNA引导Cas9蛋白切割CCR5基因(目标DNA)示意图。
①向导RNA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一种________酶。
②“GRISPR/Cas9”技术，是利用________法将Cas9蛋白和特定的引导序列导入受精卵中发挥基因编辑作用。
③基因编辑婴儿引起舆论的关注，很多科学家表示反对，请给出合理的理由______________。

8 . Hedgehog基因（H）广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，在胚胎发育中起重要作用。我国科研工作者利用基因敲除和核酸分子杂交技术研究了H基因在文昌鱼胚胎发育中的作用。
（1）在脊椎动物各个不同类群中，H基因的序列高度相似。H基因高度保守，是由于该基因的突变类型在_______________________中被淘汰。
（2）研究者使用了两种TALE蛋白对文昌鱼的H基因进行敲除，TALE蛋白的结构是人工设计的，蛋白质的中央区能够结合H基因上特定的序列，F区则能在该序列处将DNA双链切开，如图1所示。

①根据TALE蛋白的功能设计出其氨基酸序列，再根据氨基酸序列对应的___________序列推测出编码TALE蛋白的DNA序列，人工合成DNA序列之后再以其为模板进行______生成mRNA。
②将两种mRNA用_____________法导入文昌鱼的卵细胞中，然后滴加精液使卵受精，此受精卵发育成的个体为F₀代。
③F₀代个体细胞内被两种TALE蛋白处理过的DNA重新连接后，H基因很可能因发生碱基对的__而丧失功能，基因丧失功能则被称为“敲除”。
（3）提取F₀代胚胎细胞DNA，克隆H基因，用________进行切割，电泳后用放射性同位素标记的H基因片段为探针进行DNA分子杂交，实验结果如图2所示。图中样品_____代表的F₀个体中部分H基因已被敲除．研究者发现，在F₀个体产生的所有配子中，通常只有部分配子的H基因被敲除，可能的原因是__________________________________．
（4）将F₀代与野生型鱼杂交，再从F₁代鱼中筛选出某些个体相互交配，在F₂代幼体发育至神经胚期时进行观察和计数，结果如表所示。

	F2中正常幼体数	F2中畸形（无口和鳃，尾部弯曲）幼体数
第一组	101	29
第二组	106	33
第三组	98	31

根据杂交实验结果可知，F₁代鱼中筛选出的个体均为____________（杂合子/纯合子），H基因的遗传符合___________定律，随着幼体继续发育，进一步检测到的各组中正常个体数与畸形个体数的比例将会____________。