2 . 基因敲除是一种基因工程操作技术，该技术针对某个序列已知但功能未知的基因，改变其结构，使其功能丧失，进而推测出该基因的生物学功能。请分析并回答：

(1)将基因敲除杂合子小鼠雌雄互交，剪取子代小鼠尾尖，提取得到鼠尾组织基因组DNA，通过设计_______，采用PCR 方法进行扩增并电泳，得到如上图结果。图中 WT所对应的是野生型小鼠，KO和HET对应的分别是________、________。
(2)敲除基因的个体往往影响配子的存活率而影响子代及比例。科学家使用野生型(++)和基因敲除杂合子(+--)分别做母本和父本进行杂交，结果如下表。据此可知基因敲除杂合子(+--)产生含有____(填“+”或“-”)的大部分____(填“雌”或“雄”)配子致死。基因敲除的杂合子雌雄个体相互交配，基因敲除纯合子的概率是____。

杂交类型	子代及比例
+-(♀)×++(♂)	+-(49.1%)	++(50.9%)
+-(♂)×++(♀)	++(90.1%)	+-(9.9%)

(3)敲除基因的纯合子往往生活力和繁殖力低，甚至会在胚胎期死亡，妨碍了对该基因在成年动物体内功能的研究。需要重新设计实验程序，使基因的敲除发生在成年动物特定组织和特定时间内。
①研究人员找到了一段被称为 loxP 位点的DNA序列，该序列是酶C的作用位点，如下图所示，当基因X位于_______时，在酶C的作用下被敲除。

②采用基因工程等方法获得在某基因两侧插入loxP 序列的纯合小鼠A。在未导入酶C 基因的情况下，小鼠A的表现型与野生型小鼠_____(选填“相同”或“不同”)。
③在肾脏集合管细胞中，AQP2启动子特异性地与RNA 聚合酶结合并表达，现已获得另一种转纯合基因小鼠B，在转入的____前插入AQP2基因启动子序列，可以使酶C在肾脏集合管处表达。
(4)已知酶C 基因所在的染色体与loxP 序列所在染色体为非同源染色体、请利用AB小鼠，设计杂交实验获得只在肾脏集合管处进行基因敲除的纯合小鼠：____________。

3 . CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，可用于基因敲除、定向基因突变和插入外源DNA分子。CRISPR具有靶向特异性，这是由两部分决定的，一部分是向导RNA和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白复合体和一个短DNA序列（PAM序列），序列通常在靶DNA的3'末端作用。Cas9内切酶是一种RNA引导的内切核酸酶，用于通过产生序列特异性双链断裂进行基因组编辑，向导RNA则作用于体内一种称为RNA编辑的后转录修饰过程中。下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，回答下列问题：
   
(1)CRISPR是在细菌DNA中发现的一些重复序列，外来病毒DNA往往会被整合到这段序列附近并转录出向导RNA以引导Cas9内切酶切割病毒DNA。细菌细胞中的________也能起到类似Cas9内切酶的作用，使脱氧核苷酸之间的________断开。Cas内切酶________（填“会”或“不会”）切割细菌自身DNA，原因是________。
(2)在对目的细胞进行基因编辑时，需要构建含Cas9蛋白基因和设计好的向导RNA基因的________并导入受体细胞内，使其在细胞中表达出Cas9蛋白和向导RNA，并进入细胞核发挥作用。研究发现，即便向导RNA与目的序列完全互补，在PAM序列突变的情况下也无法引导Cas9内切酶，结合上图推测PAM序列的作用是________。
(3)真核细胞的DNA被切割后，会发生修复连接，便有可能实现连入供体DNA分子，也可能不会连入。若要利用CRISPR/Cas9技术敲除实验动物某个致病基因获得正常细胞，试提出操作思路：________。

5 . 阅读以下材料，回答（1）〜（5）。
基因魔剪：CRISPR/Cas系统
要揭示生命的运作原理，常需要对基因进行编辑。在过去，这一步异常艰难。但随着CRISPR/Cas技术的出现，科学家已能在极短时间内就更改生命密码。
CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因描入到指定位点。
通过在Cas9基因中引入突变，获得了只有切割一条链活性的nCas9。将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，科学家开发出了单碱基编辑技术（图2)，能够对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C→T(G→A)或A→G(T→C)的碱基替换。

对CRISPR/Cas系统的不断改造，使其在基因编辑外，还可用于激活或抑制基因的转录等。虽然目前CRISPR/Cas技术还存在一些不足，如脱靶问题等，但作为一种革命性的技术，其应用前景广阔。
（1）利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，需构建含gRNA基因和Cas基因的___________，并导入受体细胞。gRNA依据___________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割。
（2）有些遗传病是由于基因中一个碱基对的改变引起的，如果要修正此基因突变，图示的三种途径中，哪种更为合适？__________请判断并说明理由__________。
（3）如果要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从基因组序列中删除，设计gRNA的思路是___________。
（4）将CRISPR/Cas9技术用于抑制基因转录时（不改变基因结构），需对CRISPR/Cas9系统进行改造和设计，请写出基本思路__________。。
（5）将CRISPR/Cas技术应用于人类基因的编辑时，特别要注意___________方面的问题。

6 . CCR5是人体的正常基因，其编码的细胞膜CCR5蛋白是HIV－Ⅰ(人类免疫缺陷病毒Ⅰ型)感染的“入口”。有学者用“CRISPR/Cas9”技术对该基因进行定点编辑后植入志愿者体内，诞生了两位婴儿。这就是学术界和社会伦理界引起激烈争论的“基因编辑婴儿”事件请分析回答：

(1)将Cas9蛋白和向导RNA序列注入受精卵的方法称为________。据图推测，“CRISPR/Cas9”技术中，首先由________引导定位至目标DNA序列，然后由Cas9蛋白将DNA切断。这两种物质的作用结果类似于基因工程中________的作用。基因编辑过程中可能会产生“脱靶”(对CCR5基因以外的其他基因进行了编辑)现象，最可能的原因是________________________________________________________________________。
(2)细胞对被切断的DNA进行重新连接前大都会随机切掉或增加几个碱基对，此过程导致的变异属于________。胚胎2的两个变异CCR5基因编码的蛋白质中，氨基酸数目都可能减少，原因是____________________________。变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上，从而实现了________________________________________________________________________。
(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种精准改变目标DNA序列的技术。下列现代生物科技中与该技术最接近的是________。
A.转基因技术　　　B.蛋白质工程　　　C.细胞核移植　　　D.胚胎工程
(4)现今基因编辑技术门槛低，很多人在实验室里都可以做，如果不及时制止，就有泛滥的可能性。基因编辑婴儿事件，在社会上引起了激烈的争论，从科研工作者应具备的科学道德、科学精神来思考，你应持有的正确观点是________________________________________________________________________。

7 . 下图1是获取用于构建基因表达载体的含人生长激素基因的DNA片段(DNA复制子链延伸方向是5′→3′，转录方向为左→右)示意图，图2是所用质粒示意图，其上的Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^t表示四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列和酶切位点如下表。请据图回答：

限制酶识别序列和酶切位点表

限制酶	HindⅢ	BamHⅠ	PstⅠ	EcoRⅠ	SmaⅠ	BglⅡ
识别序列(5′→3′)	A↓AGCTT	G↓GATCC	C↓TGCAG	G↓AATTC	CCC↓GGG	A↓GATCT

(1) ①过程催化形成磷酸二酯键的酶有____________________，合成的人生长激素基因中________(选填“有”或“无”)与终止密码子相应的碱基序列。
(2) 引物1由5′→3′的碱基序列为________________________，引物2应含有限制酶________的识别序列；从图1的过程②开始进行PCR扩增，第六次循环结束时，图中用于构建基因表达载体的DNA片段所占比例是________。
(3) 在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成________种环状DNA。

(4) 2018年11月基因编辑婴儿事件震惊了世界，舆论一片哗然，某科研团队利用“CRISPR/Cas9”技术将受精卵中的艾滋病病毒受体基因CCR5进行修改，拟培育出具有艾滋病免疫能力的基因编辑婴儿。下图3为向导RNA引导Cas9蛋白切割CCR5基因(目标DNA)示意图。
①向导RNA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一种________酶。
②“GRISPR/Cas9”技术，是利用________法将Cas9蛋白和特定的引导序列导入受精卵中发挥基因编辑作用。
③基因编辑婴儿引起舆论的关注，很多科学家表示反对，请给出合理的理由______________。