【推荐3】叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3基因作用机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆技术是构建表达载体的一种技术如图2。

   

(1)目的基因获取，在_____条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中_____，经_____获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增除了图1标出的物质以外，还需加入_____（至少写两种）。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用_____（选项中为引物部分序列，方向为5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
(2)表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成为目前研究的热点。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合酶在反应体系中没有添加dNTP情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP情况下具有5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。请结合图1和图2回答下列问题：
①LIC技术构建表达载体，图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和_____处理。用EcoRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____处理质粒。处理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcoRⅤ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是_____，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到_____酶。
(3)导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经_____（过程）形成愈伤组织备用，用_____处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入_____植物组织培养基中培养，筛选出成功导入质粒的植物细胞。

【推荐2】水牛是重要的肉役两用家资。研究人员利用CRISPRCas9编辑系统对水牛的MS7N基因（即肌肉生长抑制素基因，对水牛骨骼肌生长有调控作用）进行敲除编辑以高效地改良水牛性状。请回答：
卵母细胞的收集和成熟：
(1)从屠宰场收集水牛卵巢，用37℃的生理盐水运到实验室。将收集到的卵母细胞放入__________培养箱中培养。
卵母细胞的体外受精
(2)在体外受精前要对精子进行_______处理。与精子进行体外受精的卵母细胞需培养到__________时期才具备与精子受精的能力。
受精卵的基因编辑；
CRISPR/Cas9编辑系统由一段具有引导作用的RNA（gRNA）和一个具有剪切DNA链
的蛋白质（Cas9）结合而成的。进行基因编辑时所设计的gRNA应具有一段与目标基因互补配对的序列（由20个碱基组成），当gRNA与目标基因互补配对后，可引导Cas9识别目标基因中与gRNA互补配对序列3'端紧邻的短序列PAM（即5'-NGG-3'，N可表示任意碱基），进而切割PAM5'端之前3-4个碱基处位点，使目标基因的两条链随机断裂，可导致目标基因碱基缺失而失活，实现基因敲除的目的。如图1。

利用电穿孔技术将CRISPR/Cas9编辑系统中的gRNA和Cas9蛋白送入水牛的受精卵中，以对MSTN基因进行敲除编辑。
(3)gRNA中与MSTN基因互补配对的序列为3'-CCGCUUCCUGUUUAUUAUAU-5'，则Cas9识别图2中MSTN基因的PAM序列为________（填序号）

(4)已知T7E1酶能识别并将基因编辑后的DNA分子切成两段，而不能识别切割未被编辑的DNA。受精卵发育到囊胚阶段，取13个囊胚中DNA进行PCR，利用T7E1酶切割后，进行琼脂糖凝胶电泳，WT为对照组，结果如图3。

①PCR时所用到的引物是根据_________基因的序列设计的。
②据图分析，被成功编辑的囊胚有_________（填数字），理由是_________。