【推荐3】全球每年约 200万人需要器官移植，而器官捐献数量远低于需求。 因此，来源于猪等动物的异种器官被视作人类供体器官短缺的希望。相比同种器官，异种器官移植面临受体对植入器官更严重的免疫排斥等难题。
通过基因敲除手段获得基因敲除猪，可获得消除或减弱排斥反应的适合人体移植的猪器官，如图1。基因敲除是指通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，主要利用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段(两端序列与靶基因相同或相近)替代靶基因片段，从而使目的基因功能丧失，如图2，该技术的缺点是重组载体也会随机插入基因组的其他序列，而达不到目的。
   
注：neo基因(新霉素磷酸转移酶基因)，能催化将ATP 的磷酸基团转移到新霉素的特定羟基，从而抑制新霉素与核糖体结合，保持核糖体的活性；HSV-tk基因(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因)，表达产生的胸苷激酶蛋白(TK)可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒性核苷酸而杀死细胞。
(1)运用基因同源重组进行基因敲除：
①胚胎干细胞(ES 细胞)的获得：基因敲除细胞一般采用ES细胞，该细胞来源于囊胚的___A.内细胞团   B. 滋养层   C. 囊胚腔)。ES 细胞培养在________中，该仪器内部提供恒定的5%的CO₂浓度，调节pH的相对稳定。培养过程中 ES细胞________(填“会”或“不会”)出现接触抑制。
②重组载体的构建：把具有与细胞内靶基因同源序列的DNA分子重组到带有标记基因的载体上，使之成为重组载体，该过程需要利用________酶。常用的标记基因有 neo基因和 HSV tk 基因，前者位于同源序列内部，后者位于同源序列外部。重组载体可通过 PCR 技术进行扩增，将加入反应成分的离心管放入 PCR仪前，需进行________操作，使反应液集中于离心管底部。
③同源重组：常采用________法将重组载体导入ES细胞，使重组载体与 ES细胞基因组中相应部分发生同源重组，从而敲除靶基因。
④筛选已表达的细胞：由于同源重组的概率极低，常利用正负筛选法(PNS法，即利用neo基因和HSV-tk基因)，需要在培养基中加入________，存活的细胞就是基因敲除的 ES 细胞。基因敲除的 ES 细胞可通过________法进一步判断目的基因是否表达出相应蛋白质，若结果为阴性，说明ES细胞基因敲除成功。
(2)通过核移植获得基因敲除猪：
①核移植需要借助精密的_________和高效的细胞融合法，核移植前，基因敲除的 ES 细胞需要进行________培养，以提高核移植的成功率。选择胚胎细胞而不是体细胞进行核移植的原因是________。
②图1过程五利用胚胎工程中的________技术，这一期间必须配制一系列含有不同成分的培养液，以满足不同发育时期生理代谢的需求；过程六需对代孕猪进行________处理，使胚胎能正常着床并发育。
(3)异种器官移植除了严重的免疫排斥外，可能还有________(写出1点)等难题需要解决。