具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌,侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加,导致结直肠肿瘤的形成。细菌培养与鉴定等传统检测技术费时费力,不能满足快速检测的需求。科研人员采用基于滚环扩增技术(RCA)的荧光标记滚环扩增检测方法,实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度和高特异性的检测。下图1为RCA的原理示意图,图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图,其中,nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因,锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子,检测探针中的荧光基团(FAM)距离淬灭基团(BHQ-1)在一定的范围内时,荧光会被淬灭。请回答下列问题。___ RCA产生长重复单链DNA过程中,Phi29DNA聚合酶既需催化___ 键的形成,也需催化___ 键的断裂。
(2)过程②为锁式探针进行连接以实现环化,该过程中需要的酶是___ 过程③中,需添加核酸外切酶进行“消化”,据图分析“消化”的目的是___ ,推测核酸外切酶的作用是___ ,消化完成后,需将反应体系置于95℃条件下持续20min后再进行RCA扩增,目的是___ 。
(3)过程④通过RCA扩增得到长重复单链DNA,与常规PCR相比,RCA缺乏___ 环节,说明RCA扩增过程中所使用的Phi29DNA聚合酶不具有___ 特性。
(4)若检测样品存在具核酸杆菌,经图2中②-④过程得到的长重复单链DNA与___ 特异性结合,导致FAM与BHQ-1距离增大,发出荧光。因为___ ,提高了该检测方法的灵敏度;肠道中含有多种微生物,为保证检测的特异性,在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG基因的特异性序列,同时还需注意无关序列中___ 。
(2)过程②为锁式探针进行连接以实现环化,该过程中需要的酶是
(3)过程④通过RCA扩增得到长重复单链DNA,与常规PCR相比,RCA缺乏
(4)若检测样品存在具核酸杆菌,经图2中②-④过程得到的长重复单链DNA与
更新时间:2024-03-19 13:11:19
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【知识点】 PCR扩增的原理与过程解读
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【推荐1】检测新型冠状病毒核酸特异性序列的方法最常见的是实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)法。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针(如图1),其V末端连接荧光基团(R),3'末端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时,R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中,当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答:
![](https://img.xkw.com/dksih/QBM/2022/4/15/2958727906852864/2959480558772224/STEM/fdc691dc-9770-452c-9022-554328db786a.png?resizew=545)
(1)结合图1和图2分析,因PCR反应模板仅为_____________ ,“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有__________ 酶、____________ 酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲体系等。
(2)若反应体系中存在靶序列,则TaqMan探针与____________ 结合,PCR反应时,___________ 酶沿模板利用外切酶的活性将探针酶切水解,放出游离的R和Q,R发出荧光信号。根据:TaqMan探针功能分析,探针中碱基序列的设计应主要依据_________________ 。
(3)每扩增一条DNA链,就有_________ 个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高,Ct值越_________ 。
(4)虽然荧光RT-PCR是当前被广泛认可的检测手段之一,但是不断有“假阴性”现象报道,通过上述过程分析,“假阴性”的可能原因有_________ (填字母)。
a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足
b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染
c.病毒核酸关键序列发生突变
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(1)结合图1和图2分析,因PCR反应模板仅为
(2)若反应体系中存在靶序列,则TaqMan探针与
(3)每扩增一条DNA链,就有
(4)虽然荧光RT-PCR是当前被广泛认可的检测手段之一,但是不断有“假阴性”现象报道,通过上述过程分析,“假阴性”的可能原因有
a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足
b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染
c.病毒核酸关键序列发生突变
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名校
【推荐2】某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt毒蛋白基因,并将其导入大豆叶肉细胞,培育出抗虫的转基因大豆,主要过程如下图。请回答下列问题:
(1)为了正确扩增Bt毒蛋白基因,并能与图中质粒正确连接,需根据___ 、___ 设计两种引物。PCR时引物的作用是___ 。
(2)PCR扩增产物可根据___ 不同,可以用___ 技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在,分析可能的原因有___ 。解决方案一般是在目的基因的___ (填“内部”或“上、下游”)重新设计引物进行PCR。
A.引物特异性不强 B.退火温度过低 C.模板DNA污染 D.引物碱基序列过长
(3)图中①为
请写出HindIII和BamHI的识别序列分别是___ 、___ 。①②过程所需要用到的酶有___ 。
(4)过程③筛选抗虫能力强的大豆,应从___ 水平上检测。
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(1)为了正确扩增Bt毒蛋白基因,并能与图中质粒正确连接,需根据
(2)PCR扩增产物可根据
A.引物特异性不强 B.退火温度过低 C.模板DNA污染 D.引物碱基序列过长
(3)图中①为
![](https://img.xkw.com/dksih/QBM/2023/9/22/3330425197666304/3330997256888320/STEM/ce698066976e4739987ec912f6047c7a.png?resizew=134)
(4)过程③筛选抗虫能力强的大豆,应从
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名校
【推荐3】稻瘟病和褐飞虱是严重影响水稻生产的两大病虫害。稻瘟病病菌种类繁多,为培育抗病虫害的水稻新品种,育种工作者进行了下列相关研究。
(1)现有纯合水稻品系甲和乙,甲对稻瘟病病菌X表现为抗病,对稻瘟病病菌Y感病;乙对病菌Y抗病,对病菌X感病。对病菌X的抗病与感病由一对基因M、m控制;对病菌Y的抗病与感病由一对基因H、h控制。
①育种工作者将甲和乙作为亲本进行杂交,得到F1,F1自交得F2。F1对病菌X和Y均表现为抗病,检测F2统计结果如下表所示。
据表推测这两对抗病基因在染色体上的位置关系为______ 。甲和乙的基因型分别为___________ 。同时对病菌X和Y具有抗性的F2植株中纯合子所占比例为___________ 。
②育种工作者根据M/m、H/h的基因序列设计特异性引物,分别对F2部分植株的DNA进行PCR扩增。已知M比m片段短,h比H片段短,扩增结果如图所示。据图判断符合选有目标的植株编号为___________ ,依据是_______ 。
①若F2对病菌Z的表型及比例为___________ ,则甲和乙对病菌Z的抗性基因可能位于同一个位点。
②若F2对病菌Z的表型及比例为___________ ,则甲和乙对病菌Z的抗病基因位于两对同源染色体上。
(3)通过筛选获得具有上述抗病基因且品质优良的纯合品系丙,欲将抗褐飞虱性状(由一对等位基因控制)与品系丙的抗病及各种优良性状整合在同一植株上,可采用的正确有种步骤是___________ (按正确顺序选填下列字母)。
a.抗褐飞虱品系与野生型进行杂交
b.抗褐飞虱品系与品系丙进行杂交
c.品系丙与野生型进行杂交
d.杂交后代自交筛选抗褐飞虱个体,使其与品系丙杂交
e.杂交后代自交筛选抗稻瘟病个体,使其与抗褐飞虱品系杂交
f.多次重复d,筛选抗褐飞虱个体
g.多次重复e,筛选抗稻瘟病个体
自交,后代中选取目的基因纯合的植株,进行稻瘟病抗性和褐飞虱抗性田间实验鉴定。
(1)现有纯合水稻品系甲和乙,甲对稻瘟病病菌X表现为抗病,对稻瘟病病菌Y感病;乙对病菌Y抗病,对病菌X感病。对病菌X的抗病与感病由一对基因M、m控制;对病菌Y的抗病与感病由一对基因H、h控制。
①育种工作者将甲和乙作为亲本进行杂交,得到F1,F1自交得F2。F1对病菌X和Y均表现为抗病,检测F2统计结果如下表所示。
对病菌Y 对病菌X | 抗病 | 感病 |
抗病 | 150株 | 53株 |
感病 | 52株 | 17株 |
②育种工作者根据M/m、H/h的基因序列设计特异性引物,分别对F2部分植株的DNA进行PCR扩增。已知M比m片段短,h比H片段短,扩增结果如图所示。据图判断符合选有目标的植株编号为
①若F2对病菌Z的表型及比例为
②若F2对病菌Z的表型及比例为
(3)通过筛选获得具有上述抗病基因且品质优良的纯合品系丙,欲将抗褐飞虱性状(由一对等位基因控制)与品系丙的抗病及各种优良性状整合在同一植株上,可采用的正确有种步骤是
a.抗褐飞虱品系与野生型进行杂交
b.抗褐飞虱品系与品系丙进行杂交
c.品系丙与野生型进行杂交
d.杂交后代自交筛选抗褐飞虱个体,使其与品系丙杂交
e.杂交后代自交筛选抗稻瘟病个体,使其与抗褐飞虱品系杂交
f.多次重复d,筛选抗褐飞虱个体
g.多次重复e,筛选抗稻瘟病个体
自交,后代中选取目的基因纯合的植株,进行稻瘟病抗性和褐飞虱抗性田间实验鉴定。
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