【推荐1】如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：

	pIJ702	pZHZ8
BglⅡ	5.7 kb	6.7 kb

表1

固体培养基中硫链丝菌素浓度（μg/mL）	0	1	2	5	10
不含质粒的链霉菌生长状况	＋＋＋＋＋	＋＋＋	＋	-	-

注：“＋”表示生长；“-”表示不生长。
表2
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_____断裂，切割形成的末端有_____两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0．4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8．上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1．由此判断目的基因的片段长度为_____kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是_____。
(3)导入目的基因时，首先用Ca^2＋处理链霉菌使其成为感受态（能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成_____过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在_____μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是_____。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的_____（填“DNA”或“RNA”）。

【推荐2】以下是基因工程四个主要操作程序：
①基因表达载体的构建   ②将目的基因导入受体细胞            ③目的基因的获取   ④目的基因的检测与鉴定
请回答下列问题：
（1）进行③操作时，可以从基因文库中获取，基因文库分为_____________ 两种，其区别是_____________ ，PCR扩增也是获取目的基因常用的方法，进行PCR时，需要向扩增仪中加入热稳定DNA聚合酶、四种原料、_____________ 以及引物，合成引物的前提是_____________ 。PCR扩增时，与引物结合的是_____________ 。
（2）进行操作①时，应先选择合适的载体，常见的载体是质粒，质粒的本质是______；如图是常用的质粒载体，基因工程中利用BamH I限制酶识别CCATCC序列，并在GG之间切割，通过BamH I限制酶切割形成的末端属于___________，科研人员利用该质粒完成基因工程，则通过___________基因供重组DNA的鉴定与选择。

【推荐3】COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有提高抗寒性的作用。转录因子CBF（由CBF基因控制合成）能够特异性结合下游的靶基因启动子区，激活COR基因的表达。将不同植物的COR基因和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能大幅提高植物的抗寒性。在构建基因表达载体时，需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶。当遇到平末端和黏性末端无法连接时，可利用Klenow酶特有的与DNA聚合酶作用相同的特性，将黏性末端补平后再与平末端连接。
(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段，根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B，在PCR过程中，经过四次循环消耗引物A和引物B共________个，引物的作用是________。
(2)现有若干种限制酶，它们的识别序列和切割位点如图所示。为将COR基因表达载体和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，应选用Hed I切割COR基因表达载体、用________切割CBF基因的某一侧后再连接。为实现CBF基因与COR基因表达载体的另一侧连接，共需用到________种酶。

   
(3)在转入超量表达载体的转基因植物中，转录因子CBF特异性识别下游的靶基因启动子区后，与________酶结合形成复合体，从而激活COR基因的表达。检测COR基因及其表达过程，可以采用的方法有________（至少写出两种）。

【推荐1】下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

(1)EcoRI断开的是_____和_____之间的_____键。一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有_____个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越_____。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna Ⅰ切割，原因是_____。
(4)与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以实现_____。BamH Ⅰ切割DNA后形成的是_____末端，写出该末端_____。
(5)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____。如果是四环素抗性基因，可以在培养基中加_____来帮助实现该作用。
(6)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_____的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

【推荐2】1992年.我国科学家成功研制出具有自主知识产权的Bt转基因抗虫棉。Bt基因的两端存在EcoRI、BamHI的酶切位点，如图甲所示；质粒表达载体如图乙所示，其中Amp^R为青霉素抗性基因，Tet^R为四环素抗性基因,P为启动子,箭头所指之处表示酶切位点。回答下列问题：
   
(1)切割图甲中Bt基因和图乙中的运载体选用的酶最好是____，原因是____。
(2)基因工程所用的限制酶主要从______中分离纯化出来，限制酶作用的化学键是_____。
(3)培育转基因抗虫棉的核心工作是_____。我国科学家将图乙所示表达载体导入棉花细胞所采用的方法是__。
(4)我国新疆棉区大规模种植抗虫棉的农场都种植了非抗虫棉作为棉铃虫庇护所，从生物进化的角度分析这样做的目的：_________。

【推荐1】为了提高菊花抗冻能力，研究者从其他生物中克隆出抗冻基因C（图1），拟将其导入菊花中。回答下列问题：

（1）构建重组质粒时需要用到的工具酶为__________________________。为使抗冻基因C在菊花细胞中高效表达，需要把目的的基因片段插入表达载体的_____________之间。
（2）若想了解C基因是否整合到菊花染色体上检测方法是采用_____________技术。
（3）若获得的转基因植株（抗冻基因C已经整合到菊花的基因组中）抗冻能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________________。
（4）将目的基因导入植物细胞还常采用的方法有（写出两种）__________________________。
（5）借助农杆菌将重组质粒导入菊花细胞，在该过程中需添加酚类物质，目的是__________。抗冻基因C的遗传特性能在菊花体内稳定存在的关键是________。
（6）科研工作者可以利用PCR技术获得更多的抗冻基因C，那么利用PCR技术获取目的基因的前提是__________________________________________。

【推荐2】科学家利用细胞工程培育了“白菜﹣甘蓝”杂种植株，如下图所示，请根据图回答下列问题：

（1）图C表示_____；由D形成E的过程称为_____，
（2）图中A、B的制备，需要去除细胞壁，此时要用到_____酶；从本质上讲，“白菜﹣甘蓝”杂种植株具有的性状是_____的结果。
（3）若“白菜﹣甘蓝”杂种植株为四倍体，则该植株的花粉经离体培养得到的植株是_____倍体，若用秋水仙素处理该花粉植株，则培育成的植株是_____。（选“纯合子”或“杂合子”）
（4）“白菜﹣甘蓝”杂种植株的食用部分是叶，但叶又易受昆虫危害而影响产量，科学家又利用基因工程培育出带有抗虫基因的“白菜﹣甘蓝”植株，请你设计实验，检测此植株的抗虫基因是否表达。
①取昆虫幼虫放到带有抗虫基因的“白菜﹣甘蓝”植株甲上，再取等量的、生活状态基本一致的昆虫幼虫放在_____植株乙上。
②适宜条件下培养一段时间后，分别观察（两植株上的）昆虫幼虫的生活情况。
③若_____，说明甲植株的抗虫基因未得到表达；若_____，说明甲植株的抗虫基因得到表达。

【推荐3】植物基因工程中，往往用光诱导型启动子(PrbcS)使目的基因表达，其结合T基因后能使目的基因更高水平表达。下图中①和②都为基因表达载体构建过程中的中间载体，请分析重组载体的部分构建过程并回答下列问题：

注：Amp^r/Km^r分别为氨苄青霉素/卡那霉素抗性基因。origin为复制原点，其余为限制酶切位点。
(1) 对双子叶植物进行基因工程改造最常用的方法是____________，还需结合____________技术才能获得新性状的植株。
(2) 中间载体通常用________法导入微生物中扩增，含有中间载体②­PrbcS­^*T的微生物与含有中间载体①­PrbcS­^*T的微生物相比，区别两者差别的方法是____________________________。
(3) 经酶切后凝胶电泳，测得2B片段为0.4kb，经图示信息分析，Prbcs­^*T的长度约为________。写出中间载体②Prbcs­^*T图中问号处限制酶的酶切位点：________________________。
(4) 如何在T基因前“点突变引入NcoⅠ”酶切位点？ ___________________。