【推荐1】Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。其原理是重组酶Cre能识别loxP位点（特定的DNA序列），并使loxP位点间的基因序列被重组或删除。受此启发，科学家在检测抗虫基因成功导入烟草细胞后，尝试用Cre/loxP重组酶系统删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因，其技术过程如下图所示（其中■表示启动子）。

(1)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有________________________等；loxP是一种含34个碱基对的小型DNA片段，由一个不对称的间隔区和两个反向重复序列组成。Cre酶能特异性地识别反向重复序列并于特定位置切开_______键，类似于基因工程中的限制酶，从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒的原理是____________。
(2)经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开，得到图中右侧的两个环状DNA分子。研究发现，抗除草剂基因在烟草细胞中不再表达，试分析其可能的原因是____________。
(3)基因工程的核心环节是____________，有时为了满足应用的需要，会在载体中人工构建____________，当诱导物存在时，可以________或抑制目的基因的表达。
(4)通常用____________法把携带抗虫基因的重组质粒甲导入烟草细胞，而重组质粒甲的受体细胞最好选择烟草幼苗的_______（填“分生区”或“成熟区”）细胞，原因是______________。

【推荐2】1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。
(1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是______________。用______________（填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
   
(2)图中是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶______________的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-TTTAAAGGG-，则对应引物设计的序列是5'-______________-3'。
(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。据此并结合图中信息简述将目的基因导入大肠杆菌，并筛选工程菌的过程______。
(4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。写出获取赖脯胰岛素基因的流程：从____________________________→设计预期的蛋白质结构→_________________________________→找到相对于的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质。

【推荐3】肠道病毒71型（EV71）为单股正链RNA病毒，是引起手足口病的主要病原体之一，在EV71中，病毒结构蛋白1（VP1）为主要的中和抗原（中和抗原与中和抗体结合后能阻止病原体入侵与增殖）。下图为利用重组大肠杆菌表达VP1蛋白，并以VP1蛋白为抗原制备单克隆抗体的过程。回答以下问题。

(1)重组大肠杆菌中，由EV71病毒的RNA构建cDNA需经过_____过程，随后cDNA通过PCR技术扩增。将目的基因导入大肠杆菌需要构建表达载体，常用的表达载体是_____。
(2)在小鼠腹腔内注射VP1蛋白进行免疫，在35天获取B淋巴细胞悬液进行融合。在获取B淋巴细胞前3天需在腹腔再次注射VP1蛋白，这样做的原因是_____。
(3)缺失HPRT基因的细胞无法在HAT培养基中生存，HAT培养基可以筛选出骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合的杂交瘤细胞，其它细胞都会死亡。据此推测，在单克隆抗体制备过程中缺失HPRT基因的细胞是_____（填“大肠杆菌”“B淋巴细胞”“骨髓瘤细胞”）。
(4)在杂交瘤细胞筛选培养过程中需在培养基中添加胎牛血清，并置于37℃、50mL/LCO₂培养箱中培养。培养箱中CO₂的作用是_____。
(5)该单克隆抗体成功制备后，对于防治手足口病有什么作用？_____

【推荐1】如图是培育优良种牛的流程图，a、b为操作过程，请据图回答有美关问题：

（1）a过程的技术名称是__________。此前，精子要进行__________________处理，此后，应将受精卵转入_______________中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。
（2）b过程常用的方法是_____________，检测外源基因是否在转基因牛D中表达成功的方法是_____；要从转基因牛D的牛奶中提取外源基因蛋白，在构建基因表达载体时应将外源基因与____________________________________________相连。
（3）为取得A、B同卵双胎，应在胚胎发育的囊胚期用机械方法将胚胎分割，其操作要注意____________________________________________________，以免影响分割后____________________________。

【推荐2】继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。
请回答：
（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是____________。
（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入________中，原因是_____________。
（3）通常采用_______技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。
（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的____细胞中特异表现。
（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠体细胞的____转入______细胞中构成重组细胞，使其发育成供体具有相同性状的个体。该技术称为_________。

【推荐3】黄曲霉毒素B1（AFB1）存在于被黄曲霉菌污染的饲料中，它可以通过食物链进入动物体内并蓄积，引起瘤变。某些微生物能合成AFB1解毒酶。
将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性。下图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图。

请回答：
（1）基因工程中将目的基因导入酵母细胞，最常用的化学方法是_____________。
（2）酵母细胞导入AFB1解毒酶基因后，采用_____________技术，检测到AFB1解毒酶基因存在酵母细胞内。实验发现酵母菌中没有检测到合成的AFB1解毒酶，分析原因可能是_____________。
（3）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的_________________________。
（4）生态工程需遵循其基本原理，系统整体性原理强调各组分之间要有_____________，只有这样地才能顺利完成能量、物质、信息等的转换和流通，并且实现__________________________。

【推荐1】血管为肿瘤的增殖和转移提供了有利条件。M蛋白是人体内抑制血管生长的因子，可作为肿瘤治疗的潜在药物。将控制M蛋白合成的基因m导入酵母细胞中进行表达，可获得大量M蛋白。如图为酵母表达载体（质粒K）的示意图（SacⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、Sa1Ⅰ为限制酶切割位点，切割产生的黏性末端均不相同）。

回答下列问题。
(1)已知基因m中无上述任一限制酶切割位点。为提高连接效率并保证基因m和载体的定向连接，对基因m进行PCR扩增时，需在基因m的上游引物和下游引物中分别引入______限制酶切割位点。
(2)将PCR扩增获得的基因m与酶切后的质粒K进行连接，构建基因m的表达载体。随后，将酶切后的质粒K（a组）与构建的表达载体（b组）分别转入大肠杆菌，并在含有氨苄青霉素的培养基上培养。已知未环化的质粒会被大肠杆菌核酸酶水解，若a组与b组培养基中均有菌落产生，a组出现菌落的原因可能是杂菌污染或______（答出1点即可）。由此推测，b组培养基上的菌落______（填“一定”或“不一定”）含有基因m。
(3)将构建成功的基因m表达载体导入组氨酸合成缺失的酵母突变体中，在______的培养基上培养，以筛选出含有表达载体的酵母细胞。
(4)若观察到M蛋白对血管内皮细胞增殖有抑制作用，说明获得的M蛋白______。

【推荐2】近年来牛乳过敏症体质者日渐增多，因此研发改造不含致敏原的食用乳品至关重要。羊乳的成分更接近于人乳，可作为牛乳过敏体质者最理想的替代乳品。研究表明山羊乳中β-乳球蛋白是引起人体过敏反应的主要致敏原，人乳铁蛋白是最初在人乳汁中发现的一种铁结合蛋白，具有抑菌和杀菌、抗病毒、调节免疫、促进铁元素吸收等多种生物学功能，是十分理想的乳品添加剂。因此，利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中β-乳球蛋白基因，再导入人乳铁蛋白基因，是提高羊乳品质的一个重要研究方向。
(1)CRISPR/Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两个部分，向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑（如图所示）。

①向导RNA通过_____识别基因序列。
②Cas9蛋白的功能与_____的功能类似。
(2)可通过_____快速扩增人乳铁蛋白基因，扩增时引物的作用是_____。为便于人乳铁蛋白与载体连接，需要在引物的5'端加上_____位点。
(3)下图表示构建人乳铁蛋白基因表达载体的过程。（图中Tet´表示四环素抗性基因，Amp´表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示）。

限制酶	BamH Ⅰ	Hae Ⅲ	Bel Ⅰ	Sau3A Ⅰ	Not Ⅰ
识别序列及 切割位点

①要将人乳铁蛋白基因插入到载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是_____。
②应将人乳铁蛋白基因与_____的启动子等调控组件重组在一起，成功导入重组载体的细胞应该放在含有_____的培养基中进行选择，再通过进一步鉴定后，可将含有重组表达载体的受精卵发育成转基因动物。

【推荐3】新冠病毒S蛋白与其侵染宿主细胞密切相关，疫苗的研究与生产有多种途径，回答以下问题。
（1）我国目前已上市的灭活新冠疫苗，是利用Vero细胞（非洲绿猴的肾脏上皮细胞）对病毒进行增殖后灭活，因此需对Vero细胞进行大量培养。传代培养时需利用胰蛋白酶使细胞分散开并制成____________。对病毒灭活是指利用物理或化学手使病原体失去感染能力，但保留原来的____________结构。
（2）S蛋白的RBD多肽区域是新冠病毒感染宿主细胞的关键。研究人员现利用基因工程技术生产S蛋白的RBD多肽片段制作重组蛋白疫苗。基本过程如下图所示：

（注：LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则成白色。）
①提取新冠病毒RINA经过____________得到的cDNA，经____________技术扩增得到RBD基因，与克隆质粒pUC质粒连接，并接种到添加____________的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为____________的菌落用液体培养扩大培养，提取重组质PUC-RBD。
②接下来应用对pUC-RBD进行酶切获得RBD基因，并与BamHⅠ酶和XhoⅠ酶切后的载体pET质粒连接。但RBD基因序列两端无相应限制酶酶切位点，现欲利用RCR技术对RBD基因进行扩增同时在其上下游区域增补上相应限制酶的识别序列，则根据下表，PCR时所用的上下游引物应分别添加的序列是____________。

限制酶	BamHⅠ	HindⅢ	XhoI	XbaI
识别序列	5'-GGATCC-3'	5'-AAGCTT-3'	5'-CTCGAG-3'	5'-TCTAGA-3'

③构建好的基因表达载体再次导入大肠杆菌培养，要检测最终是否表达了S蛋白的RBD区域，可以加入____________进行检测。
（3）有研究表明，现有的疫苗对新出现的变异类型病毒仍具有预防效果，原因是________________________。