【推荐1】科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①—④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

(1)在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。该酶的特点_____________。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶__________________对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，然后用DNA连接酶将它们连接起来。
(2)培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有___________________________作为标记基因。
(3)研究人员通常采用___________法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用_______________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。
(4)利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的_______________过程。

【推荐2】某些遗传病具有家族性遗传的特征，非家族成员一般也非携带者。下图为80年代开始采用的“定位克隆法”示意图，通过对家系分析将与某种疾病相关的基因定位在某一染色体的特定部位。(表示氨基酸的三字母符号：Met——甲硫氨酸；Val——缬氨酸；Ser——丝氨酸；Leu——亮氨酸；Gln——谷氨酰胺；Pro——脯氨酸；Cys——赖氨酸)

请据图回答问题：
（1）基因的本质是_____________。通过连锁分析定位，该遗传家系的遗传病致病基因最可能在______染色体上。致病基因及等位基因用A或a表示，则患者的基因型多为_______。若此病为隐性遗传病，且在人群中的发病率为四万分之一，则人群中正常女性个体为携带者的几率约是____________(可仅列出算式)。
（2）当初步确定致病基因的位置后，需要对基因进行克隆即复制，获取有关基因的工具是________酶，基因克隆的原料是________，基因克隆必需的酶是_________________。
（3）DNA测序是对候选基因的碱基序列进行检测。检测结果发现是基因位点发生了由_________________的改变。

【推荐3】青光眼是导致人类失明的三大致盲眼病之一，其中发育性青光眼（婴幼儿型和青少年型）具有明显族遗传倾向。下面是某家系发育型青光眼的系谱图。

（1）系谱分析表明，发育型青光眼最可能是单基因显性遗传病。根据上面系谱推测，致病基因位于__________染色体上，其遗传时遵循__________定律。
（2）检查发现，发育型青光眼患者角膜小梁细胞中M蛋白异常。为研究其病因，研究者用含绿色荧光蛋白基因G或红色荧光蛋白基因R的质粒、正常人M蛋白基因（M⁺）或青光
眼患者M蛋白基因（M^-），构建基因表达载体，分别导入Hela细胞中进行培养，一段时间后检测培养液和细胞中荧光的分布情况，实验分组及检测结果如下表（示只含荧光蛋白基因的质粒片段；示含荧光蛋白基因和M蛋白基因的质粒片段，此时两基因表达的产物是一个整体）。

		1组	2组	3组	4组	5组	6组
导入Hela细胞的质粒（局部）							和
荧光	细胞内	有红色荧光	有绿色荧光	有红色荧光	有绿色荧光	有红色荧光	有红色荧光和绿色荧光
检测	培养液	无荧光	无荧光	有红色荧光	有绿色荧光	无荧光	无荧光

①构建基因表达载体时必需的工具酶是__________。
a．解旋酶       b．DNA连接酶       c．DNA聚合酶             d．限制酶       e．逆转录酶
②荧光蛋白在此实验中的作用是________________。
③据上表推测，发育型青光眼的病因是__________，最终导致小梁细胞功能异常。
（3）上表中第__________组实验可以为“发育型青光眼是显性遗传病”这一结论提供重要证据。
（4）为进一步研究M蛋白出现异常的原因，研究者提取了M基因进行测序，然后与M⁺基因进行比对，其结果如下：

分析可知，患发育型青光眼的根本原因是基因中的碱基对由__________变成了__________，最终导致M蛋白的__________发生了改变。

【推荐1】植物对病原微生物的防御反应包含多种物质介导的多条途径,其中水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）可以诱导植物合成防御素等物质，引发防御反应。
（1）科研人员选用野生型和E3基因功能缺失突变体拟南芥，分别用一定浓度的SA、JA溶液处理，然后从各组植株中提取_________，反转录形成cDNA，再运用______技术扩增，进而检测防御素合成关键基因PDF的转录水平，结果见图1。

野生型的实验结果可说明，SA和JA对PDF基因转录的作用存在______关系。比较两组实验结果可知SA和JA的作用与E3有关。科研人员构建含有E3基因的Ti质粒，利用___________法将其导入E3功能缺失突变体拟南芥，重复上述处理后进行测定。若实验结果为__________________，则支持上述结论。
（2）PDF基因转录过程需要ORA蛋白激活。科研人员依据以下原理研究了E3蛋白与ORA蛋白之间的关系。原理如下：在酵母菌细胞中，可以利用基因工程表达出两种融合蛋白（BD—待测蛋白X、AD—待测蛋白Y）。如图2a，若两种待测蛋白可以相互作用，则AD蛋白和BD蛋白就能充分接近形成复合物，并启动组氨酸合成基因的转录；否则组氨酸合成基因不能转录（如图2b）。

由此，科研人员构建两种重组载体（见下表），将它们导入不能合成亮氨酸、色氨酸和组氨酸的缺陷型酵母菌中。

	重组载体包含的部分基因
载体1	AD蛋白基因            E3蛋白基因             亮氨酸合成基因
载体2	① 基因           ② 基因          色氨酸合成基因

上表中的相应基因分别为①____________；②____________。将转基因酵母菌接种到不含亮氨酸、色氨酸和___________的固体培养基上进行培养，观察到____________，说明E3蛋白可以与ORA蛋白相互作用。
（3）科研人员进一步研究SA在调控PDF基因转录过程中与E3和ORA的关系，结果如图3、图4所示。

分析图3可知， SA可以促进ORA基因转录，且该过程与E3无关。判断依据：与对照组相比，SA处理后的野生型和突变体中的ORA基因转录量______________。研究还发现，SA可以使E3蛋白增多。结合（2）结论和图3、图4，推测SA调节ORA蛋白量的机制是_____________，进而调控PDF基因的转录过程。

【推荐2】乙型脑炎和伪狂犬病是猪的两种常见传染病。下图是利用基因工程技术生产能同时预防这两种病疫苗的流程图，其中PrM为乙型脑炎的特异性抗原基因，PK、gG、gD为伪狂犬病的主要抗原基因，TK为伪狂犬病的毒性基因，pgG为启动子，BamHⅠ和EcoRⅠ为两种限制酶，其识别序列及切割位点分别是G^↓GATCC、G^↓AATTC。请回答下列问题：

（1）过程①所需的酶有 __________和_________。下列四种引物中适用于过程①的一对引物是________。
P1：5'TTGGATCCATGGAAGGCTCAATCATGTG3’
P2：5'CACAAGCTTAGATGACGTATCCAAGGAG3’
P3：5'TACGGTACCTTAGGGGTTAAGTGGG3’
P4：5’GCGAATTCTAACTGTAAGCCGGAGCG3’
（2）过程②所需的酶有___________。过程③中要用Ca²⁺处理大肠杆菌，其目的是___________。
（3）重组伪狂犬病毒中不带TK基因的优点是_______________。
（4）将获得的病毒疫苗注射到猪体内，一方面病毒中抗原基因在猪细胞中大量表达，诱导猪获得_______免疫；另一方面______________，使得病毒投苗具有用量小、作用更持久等优点。

【推荐1】虫草中的超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用，研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。回答下列问题：

注:Hind Ⅲ和ApaLⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。
（1）将图中的重组DNA分子用HinⅢ和ApaLⅠ完全酶切后,可得到____种DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因，不能导入用于食品生产的酵母菌中,据图分析，可用______（填限制酶的种类）切除该抗性基因的部分片段使其失效，再用_________酶使表达载体重新连接起来。
（2）作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因，必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活，因此，图示表达载体上的URA3基因可作为________供鉴定和选择，为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌，所使用的培养基______(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。
（3）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为______。为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的__________作探针进行分子杂交检测，分子杂交的原理是___________________。
（4）利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其_____________序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经____________获得所需的基因。

【推荐2】新冠病毒（+RNA）的刺突蛋白S通过与人体黏膜细胞表面的ACE2受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图1是科研人员利用新冠病毒的+RNA提取S蛋白基因和S蛋白受体结合域RBD基因作为抗原基因序列，研制新冠病毒双抗原疫苗的技术路线。已知PCR1与PCR2要分别进行，然后将产物混合，使用引物1和引物4进行PCR3，最终获得大量S-RBD融合基因（1500bp）。
   
(1)PCR3过程中，片段1与片段2连接形成S-RBD融合基因，需要使用_____酶。
(2)重组pX质粒质粒上的启动子的作用是______。为使S一RBD融合基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR1过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是____。过程B应用______酶、______酶同时切割S一RBD融合基因和质粒构建重组pX系列质粒。
(3)为初步检测过程B构建是否成功，用EcoRI、NdeI、HindⅢ对重组pX系列质粒进行完全酶切，然后对重组pX系列质粒及其酶切产物进行凝胶电泳检测，结果如图2，据图可知，重组质粒pX2和pX5构建成功的依据是_______。

   
(4)在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），在培养基B中存活的菌落是否含有目的基因_____（填“是”或“否”）。在个体水平上，鉴定重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是_____。

【推荐3】环境雌激素（EEs）是指能够扰乱动物内分泌活动，生理活性与雌激素较为相似的动物体外化学物质。斑马鱼幼鱼的卵黄蛋白原（vtg）基因在正常情况下不表达，在EEs诱导下可表达且表达水平与EEs的浓度呈正相关。为了简便直观地检测水体中EEs污染情况，研究人员培育了一种转基因斑马鱼，部分过程如图所示，相关限制酶识别序列及切割位点如表。

限制酶	识别序列及切割位点
Sph I	CGTAC↓G
HindIII	A↓AGCTT
KpnI	GGTAC↓C

请根据图表回答下列问题：
(1)上图的操作属于基因工程基本操作步骤中的______；当EEs存在时，野生斑马鱼的vtg基因启动子可以激活______基因的表达，从作用效果上来看该启动子是一种______型启动子。
(2)对vtg基因启动子进行扩增前，应设计合适的引物，并在引物的______（填“3′端””或“5′端”）添加特定的序列，使扩增后的启动子DNA片段首末两端分别含有______酶识别序列及切割位点，以便vtg基因启动子能够定向插入原始质粒的正确位置。
(3)获得的重组质粒可通过______方法导入到斑马鱼的______细胞中；为鉴定是否成功导入，应检测细胞中是否含有______（填“vtg”或“EGFP”）基因。
(4)为检测某水样M中EEs的污染情况，研究小组进行了如下实验操作：
①选取成功导入重组质粒的斑马鱼幼鱼若干尾随机均分为A、B、C三组，B组培养环境为含较低浓度EEs的培养液，A组和C组的培养环境分别是______；
②一段时间后观察并统计各组斑马鱼的绿色荧光强度，结果如下。

组别	A	B	C
绿色荧光强度	无	+	++++

注：“+”数量越多表示荧光强度越高
实验结论：________________________。

【推荐3】苯丙酮尿症是由于患者PKU基因突变引起体细胞中缺少一种酶，致使体内的苯丙氨酸代谢异常转化为苯丙酮酸，从而导致患者神经系统损害。将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上来替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因kl、k2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neo^r，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。回答下列问题：

（1）上图中通过基因定点整合过程可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞_____________，胚胎干细胞可以从_____________中进行分离得到。
（2）实验中小鼠胚胎发育到囊胚期时，聚集在胚胎一端，个体较大的细胞是_____________，可将其取出并分散成单个细胞进行培养，将来可为实验提供所需的胚胎干细胞。培养过程中培养液除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指_____________，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为_____________。
（3）用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个k基因中至少会有一个与neo^r一起整合到染色体DNA上。已知含有neo^r的细胞具有G418的抗性。kl、k2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是________的胚胎干细胞，理由_________。
（4）将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠尿液中_____________，说明PKU基因成功表达。