【推荐1】重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物如图1．图2为用定向进化策略改造纤维素酶的过程，请回答下列问题。
(1)PCR与体内DNA的复制相比，不需要_____酶的参与。
(2)根据图1所示的叠延伸PCR过程，回答下列问题。
①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物_____，大量扩增突变产物AD则应选择引物_____，重叠延伸时不需要引物的原因_____。

②若利用重叠延伸PCR技术进行定点突变时需要如下图所示的4种引物，且PCR1中的引物a位置选择的是图3中的引物1，则b，c引物分别应该选择图3中的_____。

③重叠延伸PCR通过_____ 实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是_____。
(3)图2为利用定向进化策略改造纤维素酶的操作过程，在进行③时需要先用_____处理大肠杆菌。
(4)用定向进化策略改造纤维素酶，下列说法正确的是（       ）

A．基因工程技术是定向进化策略改造纤维素的基础

B．定向进化策略获得的纤维素酶的基因序列在筛选前是已知的

C．与定点诱变相比，定向进化策略不需解析酶的结构和功能

D．定向进化策略可以使纤维素酶朝着人们需要的方向进化

【推荐2】为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

(1)进行 PCR扩增时需要耐高温的DNA 聚合酶，为使其活化应在 PCR反应缓冲液中加入____（填“Ca²⁺”或“Mg²⁺”）。
(2)有关基因序列如图2，引物 F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用____。

A.5'-ATGGTG------CAACCA-3'
B.5'-TGGTTG------CACCAT-3'
C.5’-GACGAG------CTGCAG-3’
D.5’-CTGCAG------CTCGTC-3’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是____。
(4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有____，用以控制目的基因的表达。
(5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？____。
(6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，符合要求的质粒为____。

【推荐3】吲哚胺-2，3-二氧酶（IDO）是一种含铁血红素单体蛋白，可催化色氨酸分解代谢，可能与免疫排斥反应、病原体感染、中枢神经系统疾病（如抑郁）等有关。为研究IDO表达的相关特性，研究者构建了一个能融合表达IDO和绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒IDO-EGFP-Cl。回答下列问题：   

(1)利用PCR技术获取IDO cDNA，过程如图1所示，图中①~③表示步骤，其中影响扩增特异性的步骤是______。由图可知，扩增温度设置存在差异，其中与酶无关的步骤是______。

   

(2)构建融合IDO和EGFP的重组质粒IDO-EGFP-C1（图2中KpnI、NheI、AgeI、BglⅡ均为限制酶且指向其识别序列，Kan^R为卡那霉素抗性基因，ori为复制原点，233bp的片段为IDO基因的特有序列）。已知IDOcDNA的长度为1200bp，而质粒EGFP-C1的长度为4700bp，其上EGFP的长度为780bp。图2为设计的实验流程（箭头表示正确的插入方向），研究者甲认为用引物a和引物b进行PCR扩增，再将产物用电泳鉴定，若产生______bp的DNA片段即可证明实验成功；但研究者乙认为该实验流程需修正，其最简单的方法是______。
(3)重组质粒IDO-EGFP-C1的测序。研究者乙根据其想法实施了实验并获得预期的产物，通常还需进一步通过基因测序对结果进行确认，原因是____________。
(4)转染结果鉴定。转染IDO-EGFP-C1质粒的TC-1细胞中可见荧光蛋白表达，该过程需在培养基中添加______，然后提取被转染的TC-1细胞的基因组DNA，用引物a和引物c对其进行扩增，结果如图3，则图中1为含______的TC-1细胞，2、3为______。