蜘蛛丝是自然界中机械性能最好的天然蛋白纤维，其强度高于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。但如何大量获取蜘蛛丝的问题一直难以解决。2018年8月，中科院分子植物科学卓越创新中心利用基因工程技术成功在家蚕丝腺和蚕茧中大量表达蜘蛛丝蛋白。回答下列问题：
(1)PCR是获取大量目的基因的一种方法，PCR反应体系的成分中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因_____________ ；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术_____________ （“可以”或“不可以”）为目的基因设置酶切位点。
(2)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____________ （填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）。
(3)构建基因表达载体时（如图所示），需要在目的基因前后两端分别引入_____________ 的酶切位点，该方法比用同一种酶进行酶切的优势是_____________ （答出一点即可）。
(4)研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50%，因而设计了与蛛丝蛋白基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按如图方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛛丝蛋白基因。
①改良蛛丝蛋白的技术属于_____________ 工程。
②图中所示的4次PCR都涉及到引物的选择，其中PCR1选择的引物是_____________ ，PCR4选择的引物是_____________ 。（填A、B、C、D）
(1)PCR是获取大量目的基因的一种方法，PCR反应体系的成分中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因
(2)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有
(3)构建基因表达载体时（如图所示），需要在目的基因前后两端分别引入
(4)研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50%，因而设计了与蛛丝蛋白基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按如图方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛛丝蛋白基因。
①改良蛛丝蛋白的技术属于
②图中所示的4次PCR都涉及到引物的选择，其中PCR1选择的引物是
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更新时间：2022-06-01 12:05:39
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【推荐1】2020年诺贝尔化学奖授予新型基因编辑技术CRISPR/Cas9的研发者。研究发现，细菌细胞中的一种适应力免疫系统可以侦测到病毒DNA并消灭它。病毒感染细菌后，细菌通过向导RNA把Cas9蛋白引导到外源DNA并与之结合，然后利用Cas9蛋白的DNA内切酶活性将病毒DNA分解，阻断病毒在细菌体内的繁殖。在利用基因工程生产Cas9蛋白的过程中，可以由mRNA反转录形成Cas9的cDNA。回答下列问题：
(1)Cas9的cDNA合成过程需要用到___ 酶，形成RNA-DNA杂交分子，核酸酶H破坏___ 键使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之成为单链DNA，在合成另一条链形成双链DNA时___ （填“会”或“不会”）形成DNA-蛋白质复合体，原因是___ 。
(2)获取Cas9的cDNA作为目的基因后需要通过PCR技术扩增，该技术的前提是___ ，以便合成引物，在___ 酶的作用下从引物起始进行互补链的合成。
(3)基因工程的核心是___ 。质粒中插入的目的基因的上下游应分别具有___ 才能使目的基因表达和发挥作用。
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【推荐2】角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶类，在饲料工业中具有较大的应用前景，但天然菌株产酶量低。为了获得高效表达的KerA工程菌，研究者分别构建了大肠杆菌和毕赤酵母工程菌，并实现了异源表达。下图1为含KerA基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoR1、BamH1、Sall、Xhol均为限制酶，Kanr、Tcr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。请回答下列相关问题：
(1)为了获取KerA基因，从天然菌株中提取相应的DNA片段，再通过PCR技术大量扩增，PCR技术的原理是_____ 。
(2)在构建基因表达载体的过程中，应该选用图1中的_____ 限制酶切割外源DNA和质粒DNA。
(3)将目的基因导入大肠杆菌时，常出现三种情况：未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。下图是KerA大肠杆菌工程菌的筛选示意图，结合图1所获得的重组质粒分析，下图2中的_____ （选用“A／B／C／D／E”字母作答）菌落为含有目的基因的“工程菌”。
(4)KerA基因在大肠杆菌和毕赤酵母工程菌是否实现异源表达，需要用_____ 技术检测，但经研究发现，只有毕赤酵母工程菌表达合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是_____ 。
(5)KerA在60℃以上时热稳定性差，限制了该酶的应用范围，研究人员在KerA的末端插入半胱氨酸，这不仅对酶活性影响小，且大大提高了其热稳定性。其运用到的这种现代生物技术为_____ 。
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【推荐3】人的血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲用转基因牛来大量生产HSA．下图所示为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。请据图回答问题：_____ （答出两点）等。
(2)若选用牛作为受体动物，可用_____ 作为受体细胞，通过_____ 方法将目的基因导入牛的受精卵中，然后使其发育成转基因牛。
(3)据图分析，在构建基因表达载体时，选择_____ 作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是_____ 。
(4)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322质粒而非重组质粒）的干扰，目的基因导入后，进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上_____ （填“能”或“不能”）生存，在乙培养基上_____ （填“能”或“不能”）生存。
(5)据下图分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的_____ ，需扩增_____ 次后得到HSA目的基因。
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【推荐1】B基因存在于水稻基因组中，只在体细胞和精子中正常表达，不能在卵细胞中转录。科学家为了研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了下图实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。回答下列问题：
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中_____________ ，启动子是____________ 。
(2)过程①把重组DNA分子导入农杆菌，首先必须用CaCl2溶液处理农杆菌，使细胞变得容易接受外来的DNA，然后将感受态细胞和____________ 在缓冲液中混合培养完成转化过程。当转化的农杆菌侵染植物细胞后能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并将其整合到该细胞的______________ 上。
(3)将重组DNA分子导入受体细胞，除了农杆菌转化法，我国科学家还采用的一种独创的方法是__________ ，写出该方法的一种具体操作方式_________________ 。
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中
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【推荐2】我国一科研团队将小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：
（1）我们可以通过人工方法合成TaNHX2基因，如图1表示人工合成了两条若干个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA。从功能看，Klenow酶是一种__________ 酶，获取目的基因的方法还有______________ 、____________ 。
（2）图2是3种限制酶的识别与酶切位点示意图，构建基因表达载体的时候，经BamH I酶切割得到的目的基因可以与图3所示质粒被_______________ 酶切后的产物连接，理由是________________________ 。连接后的重组质粒___________________ （填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamH I切割。
（3）基因表达载体通过农杆菌转化作用，就可以使目的基因进入某植物根细胞，并将其_______________ ，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。若要使该细胞再生出转基因植株需要采用_______ 技术。
（4）小麦与水稻差异很大，但却通过基因重组后，水稻能够合成小麦的蛋白质，这是因为_______________ 。
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【推荐3】趋化因子能吸引免疫细胞，并刺激它们做出特定免疫反应，称为趋化性反应。近日，科学家人工改造大肠杆菌使其能够识别癌细胞表面CD47蛋白，然后利用基因工程将表达趋化因子CXCL16的基因导入具有靶向功能的大肠杆菌中，使其能够定向转移至肿瘤细胞并裂解释放CXCL16招募细胞毒性T细胞攻击肿瘤细胞，该大肠杆菌菌群被科学界称为“细菌自杀小队”。目前该方案已在多种小鼠肿瘤模型（如卵巢癌、肠癌等）中起到良好的治疗效果。请回答下列问题。
(1)图中将重组质粒导入大肠杆菌，一般先用______ 处理大肠杆菌细胞。重组质粒中启动子的作用是________________________ 。
(2)为防止DNA片段反向拼接和自身环化，需用限制酶______ 同时处理质粒和含目的基因的外源DNA，并用______ 进行连接。
(3)PCR扩增CXCL16基因（5′—CGAGCTCAAGC···GGTCGCCACCA—3′），需在PCR反应体系中添加一对序列为5′—CGAGCTCAAGC—3′和______的引物（请从下列选项中选择）。
(4)为确定是否成功培育“细菌自杀小队”，研究人员将重组大肠杆菌通过静脉注射至卵巢癌模型小鼠中，一段时间后若卵巢中__________________ ，而其他健康器官中几乎未检测到重组大肠杆菌的存在，则基本能确定培育成功。
(1)图中将重组质粒导入大肠杆菌，一般先用
(2)为防止DNA片段反向拼接和自身环化，需用限制酶
(3)PCR扩增CXCL16基因（5′—CGAGCTCAAGC···GGTCGCCACCA—3′），需在PCR反应体系中添加一对序列为5′—CGAGCTCAAGC—3′和______的引物（请从下列选项中选择）。
| A．5′—GGTCGCCACCA—3′ |
| B．5′—TGGTGGCGACC—3′ |
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