【推荐1】黑水虻是重要的资源昆虫，体内H基因编码的抗菌肽HI-3具有抗菌、抗癌和免疫调节作用。科研人员利用酵母菌生产抗菌肽HI-3，并避免基因污染。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增H基因，需根据H基因设计两种引物，引物的作用有____。

A．为Taq酶提供结合位点	B．决定扩增产物大小
C．决定反应的特异性	D．决定变性时间

(2)已知H基因编码链的编码区序列是：5'-CTCGAGATGCTGCAG………GGATCCTC-TAGA-3'，扩增H基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是_____________（方向为5'→3'，写出5'端8个碱基序列）。获得H基因产物后需要进行凝胶电泳，将符合要求的条带______________以便提取纯化并进行测序。
(3)由于抗菌肽HI-3会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA中插入P和S基因，使质粒上H基因的表达受红光控制。红光调控H基因表达的原理如图1所示。

   

P和S基因表达应为_______________（从“组成型表达”“红光诱导型表达”选填）。红光调控H基因表达的原理是S基因指导合成的S蛋白直接与启动子Jub结合，P基因表达的P蛋白在_____________，启动H基因的表达过程。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统如图2，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E蛋白的基因（E₁、E₂），使F基因的表达受到蓝光控制如图3。

   

图3中E₂基因持续性表达少量的E蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力，E₁基因的作用是_____________。
(5)制药过程中需避免工程菌泄露到环境中引发基因污染。科研人员利用两种阻遏蛋白基因（T和L）和调控元件，使酵母细胞在红光和蓝光同时照射时才激活致死基因N的表达，进而诱导工程菌死亡，如图4。

   

若图中①选用的启动子为Jub，②处选用的启动子为CYC，则③④处结合的阻遏蛋白分别为______________。
(6)请结合上述分析，利用该工程菌发酵生产抗菌肽HI-3各阶段需控制的光照条件是：I菌种培养阶段_____________；Ⅱ菌种发酵阶段____________；II产物分离阶段_____________；IV安全处理阶段红光、蓝光同时照射。

【推荐2】糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒的部分结构如图1所示。三种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：

限制酶	BamHI	PstI	XbaI
识别序列和切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

(1)将诱变处理的黑曲霉培养在以淀粉为唯一碳源且加人碘液的培养基中培养一段时间后，挑选透明圈直径________（填“较大”或“较小”）的菌株，并从中提取DNA，提取时向含DNA的滤液中加人预冷的酒精溶液后进行离心，取________（填“上清液”或“沉淀物”）即获得黑曲霉DNA。
(2)利用PCR的方法从提取的DNA中获取目的基因时需要引物，引物的作用是________。下图为目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列，引物1（A端的引物）：5′________3′，引物2（B端的引物）：5′________3′。为了使目的基因能够正向插入质粒中，设计引物时还应在引物1和引物2的_______端分别添加_______的识别序列，PCR时，需要设置的循环温度依次为90℃以上、_______℃左右和72℃左右。

(3)将基因表达载体导入毕赤酵母菌后，需要在添加有氨苄青霉素的培养基上培养，目的是_______。检测导入目的基因的毕赤酵母菌对淀粉的分解情况，可将毕赤酵母菌培养在添加_______成分的以淀粉为碳源的固体培养基中。

【推荐1】科研人员利用I型糖尿病模型小鼠进行实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。技术路线如下（基因转录方向为启动子→终止子）。

1．以下细胞中可获得人胰岛素编码序列的是（　　）

A．胰岛A细胞

B．胰腺细胞

C．肝细胞

D．肾上腺髓质细胞

2．在胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，可确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析科学合理的是（　　）

A．短肽编码序列不能改变B链氨基酸序列

B．短肽编码序列中不能含终止密码子

C．短肽编码序列不能改变A链氨基酸序列

D．短肽不能改变原胰岛素抗原性

3．若B链碱基长度为90bp （1bp=1个碱基对），A链碱基长度为63bp， 不考虑终止密码子，翻译出的重组人胰岛素（不含信号肽）含氨基酸57个，则短肽碱基长度为______bp。
4．在重组表达载体中，SacI 和Xba I限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成____种DNA片段。其中加入DNA连接酶后能自身环化的片段至少有_______种。

A．1

B．2

C．3

D．4

5．检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是（文字加箭头）：_______→细胞壁

【推荐2】磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。

注：bar为草胺膦抗性基因；Kan^r为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿_____（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成_____。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性， _______。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是______，过程③所需的酶有_______。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。

A．不受限制酶切位点的限制

B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变

C．操作相对简单，成功率高

D．不需要使用PCR技术扩增目的基因

(4)PCR扩增PABD基因时需依据______的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的片段的所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。

①	5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´
②	5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´
③	5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´
④	5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´

(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有______的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中_____，了解PA的分布和含量。

【推荐3】科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌工程菌，成为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如图1所示，天然大肠杆菌不具备图1中所示基因。启动子有利于RNA聚合酶识别并启动特定基因的转录，CFP蛋白可在一定条件下发出荧光。

(1)在上述研究中，必须导入天然大肠杆菌的目的基因有__________（填写编号）。
①TetR基因             ②GFP基因             ③四环素合成相关基因             ④RNA聚合酶基因
(2)据图1，当环境中不含四环素时，该大肠杆菌工程菌__________（填“能发出”或“不发出”）荧光。试概述该种四环素检测方法的原理__________。
(3)图2表示2个DNA片段、质粒及其上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布情况；其中质粒上的Amp^r代表青霉素抗性基因。下表为相关限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点。

限制酶	EcoRI	XbaI	SpeI	BamHI
识别序列及切割位点	5'-G↓AATFC-3' 3'-CTTAA↑G-5'	5'-T↓CTAGA-3' 3'-AGATC↑T-5'	5'-A↓CTAGT-3' 3'-TGATC↑A-5'	5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5'

若要拼接DNA片段1和2，结合图2和表中信息

编号	①	②	③	④
拼接位点处的碱基序列	5'-TCTAGA-3' 3'-AGATCT-5'	5'-TCTAGT-3' 3'-AGATCA-5'	5'-ACTAGA-3' 3'-TGATCT-5'	5'-ACTAGT-3' 3'-TGATCA-5'

，在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为__________（填写编号）。
(4)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP的第65位丝氨酸突变成苏氨酸后，增加了绿色荧光稳定性和强度。该项技术属于__________（填写编号）。
①基因的定点突变             ②基因的定向进化             ③细胞工程             ④蛋白质工程

【推荐1】瑞典遗传学家斯万特·帕博从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，并在大肠杆菌中进行克隆，复制了2400年前的DNA，荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。某兴趣小组的同学模拟了其中部分研究过程。请回答下列问题：
(1)该兴趣小组的同学为了提高实验成功率，采用PCR技术对木乃伊基因进行扩增，PCR反应体系中需添加的物质有缓冲液、______（答出两点），dNTP和引物等，引物需要根据______进行设计。一个该DNA分子在PCR仪中经过4次循环，需要_______个引物。
(2)构建重组质粒时需要使用的酶有_______，重组质粒上启动子的作用是______。在向大肠杆菌导入重组质粒前，应用______处理使大肠杆菌处于感受态。
(3)若实验过程中该兴趣小组的同学采用限制酶BamHⅠ对目的基因和质粒进行切割，经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中木乃伊基因不能正确表达，其最可能的原因是______。为有效解决此类问题，措施是_______。

【推荐3】昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）是以杆状病毒（遗传物质为双链、环状闭合DNA）作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行基因组自我扩增与目的蛋白的表达。下图是利用BEVS生产人生长激素（hGH）的过程（杆状病毒基因B中kan^r为卡那霉素抗性基因；LacZ基因编码的β­半乳糖苷酶能将无色化合物X­gal转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，若LacZ基因不能正常表达的菌落呈白色）。请回答下列问题：

(1)图中的人生长激素mRNA是从人体的________细胞中获取。图中①过程的进行需要引物（一般为色氨酸的tRNA），这是由于逆转录酶不能将单个的________聚合成DNA链。逆转录酶在引物tRNA________末端以________方向合成DNA。
(2)步骤②为重组质粒P的构建，分别用BglⅡ、EcoRⅠ切hGH基因，用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切质粒P，再用________连接，若图1是BglⅡ的识别序列，则最可能是BamHⅠ的识别序列是________。

(3)步骤③需筛选含重组杆状病毒基因B的大肠杆菌，筛选用培养基必须加入________、________、________，要获得图示培养结果，需用________法进行接种，应挑选________菌落进行重组基因的扩增与提取。
(4)昆虫杆状病毒可以作为表达载体，是利用其具有________的特性而将目的基因导入受体细胞。

【推荐1】图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（ter）和氨苄青霉素抗性基因（amp^r）。请回答下列问题：

（1）EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用Taq 酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸形成P2，P2和目的基因构建成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，分别写出另外两类菌落质粒导入情况分别是_____________、 _____________。

平板类型 菌落类型	A	B	C
无抗生素	﹢	﹢	﹢
氨苄青霉素	﹢	﹢	﹣
四环素	﹢	﹣	﹣
氨苄青霉素+四环素	﹢	﹣	﹣

（4）若改用植物作为目的基因的受体，在噬菌体和植物病毒两种载体中，不选用__________________作为载体，其原因是_____________________。
（5）基因工程经常选用大肠杆菌作为受体。因为与植物动物相比，大肠杆菌具有_________________（答出两点即可）等优点。
（6）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是_________________________。

【推荐2】在基因工程的操作过程中，有多种方法可检测目的基因是否导入受体菌，回答下列问题。
环丝氨酸辅助筛选法
四环素能使细菌停止生长但不致死；环丝氨酸能使正常生长的细菌致死，而对停止生长的细菌不致死。某质粒如图所示（表示氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因），中插入目的基因后失活。用此质粒构建表达载体，转化细菌后，结果有种：未转化的细菌、含空质粒的细菌、含重组质粒的细菌。
   
(1)用含有______的培养基对上述3种细菌进行筛选，只有含空质粒的细菌被淘汰，原因是______。
(2)在上述筛选的基础上，若要筛选出含重组质粒的细菌，还需使用含有的______培养基。
荧光定量技术
在反应体系中，加入的荧光探针与模板的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，荧光监测系统就会接收到荧光信号，具体原理如下图所示。
   
(3)可通过检测______判定待测细菌中是否含有模板，且荧光达到某一特定强度所需的循环次数越______，初始时模板含量越高。
(4)通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入______。（填字母）
a．转基因细菌的模板        b．非转基因细菌模板       c．定量的待测引物d．定量的待测荧光探针       e．耐高温的聚合酶     f．解旋酶g．足量的脱氧核苷酸（）     h．扩增缓冲液i．ATP

【推荐3】番茄营养丰富，是人们喜爱的一-类果蔬。普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐贮藏。科学家通过基因工程将- -种抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞，获得了抗软化番茄。下图是通过基因工程培育抗软化耐储藏番茄的过程及原理。请分析回答下列问题：

（1）利用基因工程将目的基因导入植物细胞，目前采用最多的方法是_______，该方法中用到的载体是_______，目的基因需插入到该基因载体的_______上。
（2）构建基因表达载体时必需的工具酶有_______。
（3）图中步骤①→②使用的生物技术是_______，这种技术可保留番茄植株抗软化保鲜时间长的优良性状。
（4）根据图中转基因番茄细胞中的信息传递过程，分析转基因番茄抗软化的原因：_______。
（5）培养转基因植物为避免外源基因通过花粉传播进人其他植物，可将外源基因导入_______（填“细胞核”或“细胞质”）。