【推荐1】下图是基因工程的基本操作流程图，回答相关的问题。

(1)图中①是用_______切割，②是_______，④是________，⑤是_________。与④相比，cDNA文库的基因中_________ (填“有”或“无”）启动子（具有启动作用的DNA片段），基因的数量_________ (填“多”、“少”或“不变”）。
(2) PCR的原理是_________，需要用的酶是_________。PCR —般要经历三十多次循环，每次循环分为_________三步。利用PCR技术进行扩增目的基因的前提是_________。使用PCR技术，若已知对某双链DNA扩增过程中消耗引物分子62个，则DNA扩增了 _________次。
(3)在“农杆菌转化法”中，运载体是质粒,但最终的受体细胞却不是大肠杆菌和酵母菌，而是不含质粒的双子叶植物和裸子植物的细胞，请问使用农杆菌的原因是_________。

【推荐2】新冠病毒（nCoV-2019）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，但nCoV-2019有部分特有序列。“实时荧光定量RT-PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1~2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针（如图1），其5'末端连接荧光基团（R），3'末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。回答下列问题：

(1)PCR技术____________（填“可以”或“不可以"）用来获取目的基因；PCR技术中Taq酶的适合温度范围是____________。
(2)这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的___________、___________有关。
(3)在实时荧光定量RT-PCR过程中，通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图（如图3）。最初数个循环里，荧光信号变化不大，设置为基线；之后进入指数增长期，在这个时期设置一个荧光阈值线；Ct值是PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，则Ct值越小，起始模板量越____________，从而实现对起始模板的相对定量分析。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与___________、____________有关。

(4)新冠病毒核酸检测也存在一定的弊端，如交叉感染和假阳性等，请根据所学知识及题中资料分析防止出现假阳性的做法：___________。（答出2点）

【推荐3】为生产高效价疫苗和简化计划免疫程序，科学家研制出基因工程乙肝-百白破（rHB-DTP）四联疫苗，经各项检测均通过rHB-DTP四联疫苗制检规程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌的四种类毒素。请分析回答下列问题：
（1）为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应________，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列_____________（填“相同”或“不同”）。
（2）由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用______，然后通过_____大量扩增，此技术的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
（3）把目的基因导受体细胞时，科学家采用了改造后的腺病毒作为载体，写出你认为科学家选它的理由________________________。（写出2点）
（4）研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程_________________。
（5）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的______数量增多，当同种抗原再次侵入人体时，机体在更短时间内产生体液免疫的原因是_______________________。

【推荐1】B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。

据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________。
A．含B基因的染色体缺失B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变D．B基因的启动子无法启动转录
（2）在过程①②转化筛选时，过程__________中T－DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程__________在培养基中应加入卡那霉素。
（3）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明____________。

【推荐2】将几丁质酶基因导入棉花细胞中,可获得抗真菌的转基因棉,其过程如下图所示(注:农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中)。

(1) 图中基因工程的基本过程可以概括为“四步曲”，其中的核心步骤是__________________。
(2)构建重组Ti质粒用到的工具酶是___________________。 
(3) 该几丁质酶在温度较高时易失去活性，科学家对编码几丁质酶的基因进行了改造，使其表达的几丁质酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了其耐热性。资料中的技术属于__________________工程范畴，其基本途径是从预期蛋白质的功能出发，通过__________________和人工合成的方法获得该基因，再经表达、纯化获得蛋白质。
(4)检验转基因棉的抗菌性状，常用方法是___________________________。
(5)除了图中所示的将目的基因导入受体细胞的方法，还可用_______________或____________方法。
(6)棉花细胞经③④⑤得到试管苗，依据的理论基础是______________________。

【推荐3】人乳头瘤病毒（简称HPV，遗传物质为DNA）感染是引发宫颈癌的最主要因素。我国研制的HPV疫苗和抗L1蛋白单克隆抗体对宫颈癌的预防有良好的效果，已知L1蛋白是HPV表面的一种主要蛋白质。根据所学知识，回答下列问题。
(1)用基因工程制备HPV疫苗，首先可以通过PCR扩增目的基因。PCR利用了___________的原理，扩增过程中反应体系温度变化为升温→降温→升温，其中降温的目的是____________。
(2)基因工程操作的核心步骤是___________，此步骤需要的酶是___________和___________。
(3)在制备抗L1蛋白单克隆抗体时，需要将小鼠B淋巴细胞与鼠的骨髓瘤细胞融合，再用特定的培养基进行筛选。在该培养基上，未融合的细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞能正常生长。上述获得的杂交瘤细胞不能直接用来制备抗L1蛋白单克隆抗体，需要再次对细胞进行筛选，筛选的目的是___________。
(4)抗L1蛋白单克隆抗体主要的优点是___________（答出两点即可）。

【推荐1】科学家将人的生长素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。过程如下图据图回答：

（1）人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是_______________。
（2）过程①表示的是采取______的方法来获取目的基因。其过程可表示为：_________________________。
（3）图中（3）过程用人工方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用________处理，使细胞成为_______________细胞，再将表达载体溶于________________中与其混合，在一定的温度下完成转化。
（4）检测大肠杆菌B是否导入了质粒或重组质粒，可采用的方法是_________________________，理由是：_________________________。
（5）如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，发生的现象是____________________，原因是：_________________________________。

【推荐2】抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小分子肽，具有广谱抗菌活性，对病毒和癌细胞都有一定的杀伤力，科研人员将抗菌肽基因导入大肠杆菌细胞内获得了能高效表达抗菌肽的工程菌。请回答下列问题。
（1）利用PCR技术扩增抗菌肽基因时，设计的引物之间不能________，以避免引物自连。反应体系中，使模板DNA解旋的操作方法是________，加入的Taq酶所起的作用是________。
（2）大肠杆菌含有许多蛋白酶，在制备抗菌肽目的基因表达载体时宜选用分泌型载体。分泌型载体能将抗菌肽在信号序列的指引下运出细胞外，使用分泌型载体的突出优点是________。将基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用________处理大肠杆菌制备________细胞。
（3）抗菌肽本身对大肠杆菌具有一定的杀伤性，对抗菌肽的分子构造进行改造，可得到对大肠杆菌杀伤性小的抗菌肽，该改造技术直接改造的对象是________。

【推荐3】同源重组指发生在同源DNA分子的同源序列（即碱基序列相同或相近）之间的一种重组形式。某实验小组利用同源重组的方法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入真核表达载体的过程如图所示，其中A~D表示操作流程。回答下列问题:
   
(1)载体线性化后进行的PCR过程中引物的作用是______，与细胞内的DNA复制不同，PCR反应体系中需要加入__________酶。
(2)图中A、B两处PCR过程中要在载体和目的基因的两端添加____。重组产物一般会转入感受态细胞，获得感受态细胞时一般先用______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(3)与利用限制酶和DNA连接酶构建重组质粒的常规方法相比，用该方法构建重组质粒的最大优点是______。

【推荐1】凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向。从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。
(1)从牛胃细胞中提取___________________，再逆转录形成 cDNA，以此 cDNA 为模板 PCR 扩增目的基因，有时需要在引物的5’端设计_____________（填“限制酶”“DNA 连接酶”或“RNA 聚合酶”）识别序列，以便构建重组 DNA 分子。

(2)构建重组 DNA 分子（如图 1 所示）最好选用_______________限制酶，理由是___________。
若研究人员获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组质粒，如图 2 所示。这三种重组质粒中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是______________________。

(3)工业化生产过程中，最初多采用重组大肠杆菌或芽孢杆菌生产凝乳酶，现多采用重组毛霉生产，相较于大肠杆菌，毛霉作为受体细胞的优势是_______________________________。
(4)研究发现，如果将该凝乳酶的第 20 位和第 24 位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2 倍。通过蛋白质工程生产高效凝乳酶，所需步骤有_______________________。
a．蛋白质的结构设计 b．蛋白质的结构和功能分析 c．蛋白质结构的定向改造d．凝乳酶基因的定向改造 e．将改造后的凝乳酶基因导入受体细胞f．将定向改造的凝乳酶导入受体细胞

【推荐2】利用基因工程培育抗病香蕉的流程如下，回答下列问题：

（1）获得抗病基因后，常利用__________技术进行扩增，利用该技术扩增的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。该技术的完成需要_____________ 酶。
（2）使用农杆菌将抗病基因导入香蕉细胞中，农杆菌中的Ti质粒上的_________可将抗病基因转移至香蕉细胞的___________________上。
（3）卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长。欲利用添加了卡那霉素的培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，则基因表达载体A的构建时，应含有___________， 以作为标记基因。
（4）抗病基因进入香蕉细胞内，并在香蕉细胞内维持稳定和表达，该过程称为____________________。
（5）欲检测抗病基因是否表达出蛋白质，可从转基因抗病香蕉中提取蛋白质，用_______________ 予以检测。

【推荐3】人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中 lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的 X—gal，产生蓝色物质， 使菌落呈现蓝色， 否则菌落为白色。

(1)图中过程①中有两种选择限制酶的方案，它们分别是____或____。过程②需要先将大肠杆菌用____处理。
(2)PCR过程每次循环分为3步，其中发生引物与单链DNA结合的步骤称为____，得到的产物一般通过____的方法来鉴定。在 PCR反应体系中一般需要加入Mg²⁺，原因是____。
(3)据图可知，该目的基因的具体功能是____。为了使重组质粒中目的基因正常表达， 还需要插入的序列有____。
(4)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入____和____培养一段时间挑选出____色的菌落进一步培养获得大量目的菌。