【推荐1】东北酸菜是白菜经乳酸菌发酵而成的传统食品。发酵过程中霉菌等大量繁殖会导致酸菜腐败而发臭。黑龙江大学研究团队从酸菜中分离出一种具有高效抑菌活性的乳酸菌，利用其发酵成的“黑大酸菜”，适合上市推广。回答下列问题：
(1)为分离获得具有高效抗菌活性的乳酸菌菌种，需要从市售保藏期____________（填“较长”或“较短”）的酸菜中进行筛选。
(2)分离纯化乳酸菌所用的固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙而产生溶钙圈。通常，可利用_法对培养基进行灭菌，选择有溶钙圈的菌落，采用____________法可获得由单个乳酸菌繁殖而形成的纯培养物。
(3)下表为实验所得到的部分乳酸菌对青霉菌的抑菌活性有关数据，通过比较应选择乳酸菌编号为____________的菌株进行后续实验，原因是____________。

乳酸菌编号	L1	L2	L3	L4	L5	L6
抑菌率/%	28.57	19.48	58.44	14.28	6.49	36.36
抑菌效果	-	-	++	-	-	+

注：“-”无抑菌作用；“+”抑菌率为30%~50%；“++”抑菌率在50%以上
(4)研究表明，（3）中筛选出的乳酸菌具有高效抑菌活性是由于其分泌了一种新型细菌素（多肽），其在食品防腐方面具有明显的优势，但是产量较低。现欲利用基因工程技术获得纯化的细菌素，以便提高其产量。下图分别为目的基因、基因表达载体示意图及转化后对目的基因进行PCR检测的结果。

①利用PCR技术扩增细菌素合成基因时，应选择的一对引物是____________。构建基因表达载体时，应在与甲链结合的引物中加入____________（填“BamHⅠ”或“NdeI”）的识别序列。
②PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是____________。
③电泳结果表明____________。设置4号的目的是____________（答出一点即可）。

【推荐2】研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人体主要过敏源，图1为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因，同时导入人乳铁蛋白（hLF）基因并获得转基因山羊的操作过程。图1中sgBLG/Cas9复合物中，sgBLG为能准确识别图1中母羊甲DNA特定序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。

回答下列问题
(1)上述操作过程中的目的基因是____。Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的____酶。
(2)图中③应用到的技术为____。
(3)为获取更多母羊丙的卵母细胞，需对丙注射____，并对获取的细胞进行培养至____期后去核，去核的目的是____。早期胚胎移植之前，需对母羊丁进行____处理。
(4)研究人员利用人乳铁蛋白基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA，已知mRNA的序列为5’-UUACUUCCUG…（中间序列）…CAAGUUUCAU-3’。在目的基因两端加上相应的限制酶识别序列后利用PCR技术扩增，目的基因和图2中的质粒连接构建表达载体。请分别写出PCR扩增时所需两种DNA引物按5’到3'方向的前12个碱基序列____。

(5)筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白，____（填“能”或“不能”）作为目的基因是否成功导入并表达的依据，理由是____。

【推荐1】“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答：
(1)水稻（2n=24）是禾本科植物，在我国有野生种、引进种：杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，这主要体现了生物多样性的______________价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测_____________条染色体中DNA的碱基序列。
(2)安农S-1是我国发现的第一个籼稻（水稻的一个品种）光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，得到的F₁均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是：_______________。
(3)另有一个水稻品系，其雄性的育性由一对等位基因M、m控制，基因型为mm的个体表现为雄性不育，能产生正常的雌配子，M基因可使雄性不育个体恢复育性产生可育雄配子。通过转基因技术将M基因与雄配子致死基因A、蓝色素生成基因D一起导入基因型为mm的个体中，并使其插入一条不含m基因的染色体上（D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色）。如图：

①图中基因型为mmADM的个体自交时（不考虑突变和互换），子代种子的表型及比例为_____________，这种转基因改良品系的显著优点是_______________。
②要成功得到转基因个体（mmADM），先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M基因的运载体（如下图）中再插入A、D融合基因。他们分析发现A、D融合基因拼接处存在XbaI的识别序列，为使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达，应
在A、D融合基因两端添加______________两种限制酶的识别序列，并用_____________两种限制酶对运载体进行酶切。

【推荐2】野生型大肠杆菌（E．coli）具有完整的LacZ基因，该基因编码的β-半乳糖苷酶由α片段和ω片段两部分组成，两部分均存在时可将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，从而使整个菌落变为蓝色。DH5α是基因工程中常用的一种大肠杆菌诱变菌株，对氨苄青霉素敏感，其LacZ基因中编码ω片段的序列仍然保留，但编码α片段的序列缺失。
（1）根据中心法则，LacZ基因控制β-半乳糖苷酶合成的过程主要包括_____和______两个环节。
（2）某研究小组构建了质粒pXY-1，如图甲所示，该质粒含氨苄青霉素抗性基因Amp^r和编码大肠杆菌β-半
乳糖苷酶α片段的基因片段LacZ’。图乙显示的则是Nae I、Hpa II和Kas I三种限制性内切酶的识别序
列（表示切割位点）。
   
若以该质粒作为运载体，将外源目的基因（图丙）导入大肠杆菌DH5α菌株，在构建重组质粒时应选用的限制性内切酶是______。此外，还需用到的另一种酶是______。
（3）若用涂布有氨苄青霉素和X-gal的固体培养基筛选上一题中含目的基因的受体菌，下列说法中正确的有______。

A．没有导入任何质粒的DH5α细菌可以在该培养基上生长且菌落为白色

B．导入了pXY-1空载体质粒的DH5α细菌可以在该培养基上生长且菌落为蓝色

C．导入了pXY-1重组质粒的DH5α细菌可以在该培养基上生长且菌落为白色

D．导入了pXY-1重组质粒的DH5α细菌可以在该培养基上生长且菌落为蓝色

（4）．现从上一题的固体培养基平板上挑取一个重组菌落，经扩大培养后提取质粒，分别用不同的限制性内
切酶处理并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如表所示：

所用限制性内切酶	所得条带长度
BamH I、Sca I双酶切	1230bp、2770bp
Hpa II、Sca I双酶切	460bp、1240bp、xbp

分别用不同的限制性内
切酶处理并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如表所示：据此可知，目的基因全长为______bp，在其内部存在______（填限制酶名称）的切割位点，表中字母x代表的数值应为______。

【推荐3】（四）回答基因工程的相关问题：
如表是几种限制酶识别序列及其切割位点，左图、右图中标注了相关限制酶的酶切位点，请回答下列问题：

1．用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用BclI酶和_________酶切割，酶切后的质粒和目的基因片段，通过______________ 酶作用后获得重组质粒。
2．若用上述限制酶获得的目的基因长度为1.0 kb（1 kb = 1000对碱基），质粒长度为3.2 kb，则获得重组质粒的长度为______。
A. <   4.2 kb       B. >   4.2 kb       C. = 4.2 kb
3．重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅在10^-7，为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌，在导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是______，可能性最大的是______。
A. 在含氨苄青霉素的培养基上能正常生长,在含四环素的培养基上不能正常生长
B. 在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长
C. 在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都能正常生长
D. 在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长
4．用Sau3A I限制酶______（填 能或不能）识别并切割BamHI酶的识别序列，若用Sau3A I限制酶完全切割图24质粒时，可获得__________种大小不同的DNA片段。
5．若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需将重组质粒导入至山羊的________________细胞中，那么上述过程属于_______。

【推荐1】已知图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，且限制酶的切点是唯一的，外源DNA插入会导致相应的基因失活。请回答有关基因工程操作的问题：

(1)图1表示的是一个经过____的作为载体的质粒。作为基因表达载体除图1所示结构外，还需具有____。
(2)根据图中所给信息，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是____。若将基因表达载体导入大肠杆菌，一般先用钙离子处理，使其成为感受态细胞，以利于____，然后调控温度完成转化过程。
(3)为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，应在培养基中添加____；培养一段时间后，平板上长出菌落。用PCR技术鉴定时，所用的引物是图2中____。PCR技术扩增目的基因，每一循环包括变性、____、____三步。

【推荐2】幽门螺杆菌（H·pylori)能导致严重的胃部疾病。科学家运用基因工程技术将幽门螺杆菌基因组的HspA基因成功导入烟草细胞，最终表达的疫苗使人体获得持久性的疾病防御能力。请回答下列问题：
（1）通常采用PCR技术扩增HspA基因，前提是要有一段已知HspA基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成__________，合成物质的作用是___________________。
（2）PCR技术扩增目的基因过程中使用的DNA聚合酶要耐高温的原因是____________________，这种酶能在热泉中被筛选出的原因是____________。
（3）将HspA基因插入农杆菌Ti质粒的_______中，然后用该农杆菌感染烟草细胞，最终将目的基因整合到烟草细胞的_________上。烟草细胞需要_________(填写过程）发育成完整植株。
（4）将幽门螺杆菌基因组的HspA基因表达的物质作为__________，引起人体的特异性免疫应答。

【推荐3】阅读以下材料，回答（1）～（3）。
基因魔剪：CRISPR/Cas系统
要揭示生命的运作原理，常需要对基因进行编辑。在过去，这一步异常艰难。但随着CRISPR/Cas技术的出现，科学家已能在极短时间内就更改生命密码。
CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因插入到指定位点。
通过在Cas9基因中引入突变，获得了只有切割一条链活性的nCas9。将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，科学家开发出了单碱基编辑技术（图2），能够对靶位点进行精准的碱基编辑。

对CRISPR/Cas系统的不断改造，使其在基因编辑外，还可用于激活或抑制基因的转录等。虽然目前CRISPR/Cas技术还存在一些不足，但作为一种革命性的技术，其应用前景广阔。
(1)利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，需构建含gRNA基因和Cas基因的________，并导入受体细胞。gRNA依据________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割。
(2)有些遗传病是由于基因中一个碱基对的改变引起的，如果要修正此基因突变，图示的三种途径①②③中，哪种更为合适？_________，因为_____________。
(3)通过①途径仅能够实现某基因内部少量核苷酸的插入或缺失，如果要将该基因从基因组序列中删除，利用CRISPR/Cas9技术，设计gRNA的思路是_________。

【推荐2】某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt毒蛋白基因，并将其导入大豆叶肉细胞，培育出抗虫的转基因大豆，主要过程如下图。请回答下列问题：
   
(1)为了正确扩增Bt毒蛋白基因，并能与图中质粒正确连接，需根据___、___设计两种引物。PCR时引物的作用是___。
(2)PCR扩增产物可根据___不同，可以用___技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的原因有___。解决方案一般是在目的基因的___（填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。
A.引物特异性不强       B.退火温度过低       C.模板DNA污染   D.引物碱基序列过长
(3)图中①为请写出HindIII和BamHI的识别序列分别是___、___。①②过程所需要用到的酶有___。
(4)过程③筛选抗虫能力强的大豆，应从___水平上检测。

【推荐3】金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将MT基因导入大肠杆菌构建工程菌，利用这一工程菌吸附工业废水中的重金属。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，从____________中提取mRNA，通过___________法获得MTcDNA。MTcDNA的碱基序列与细胞中MT基因的碱基序列___________（填“相同”或“不同”）。
(2)为了提高工程菌MT蛋白的产量，将MT基因与外源表达增强元件连接（图甲表示引物对应的位置）。利用PCR检测连接是否成功，可选择的引物组合是___________（填字母）.

A．①+③                    B．①+④                    C．③+④
该PCR反应体系中需加入_____________酶。
(3)将改造后的目的基因进行PCR扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E只有能产生黏性末端的酶切位点。为了能够将MT基因与载体E相连，可以在上述引物的______________（填“5’”或“3’”）端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P将MT基因接入载体E。（图乙表示载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列）

后者具体操作步骤如下：
①选用______________酶将载体P切开，再用DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P'。
②载体P'不具有表达MT基因的_______________和_______________。选用______________酶组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接。为了提高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因的浓度外，还需考虑_____________（写出两点）
(4)将重组质粒导入到用_____________处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有_____________的培养基筛选出MT工程菌。
(5)通过检测发现MT基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属，可能的原因是：____________。