组卷网 > 高中生物综合库 > 生物技术与工程 > 基因工程 > 基因工程的基本操作程序 > 目的基因的获取 > PCR扩增的原理与过程
题型:非选择题-解答题 难度:0.4 引用次数:122 题号:22634512
狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)感染中枢神经系统引起的传染病,人和动物感染后一旦出现临床症状,死亡率几乎100%。当前,接种疫苗和抗体注射是预防狂犬病最为有效的途径。RABV是一种RNA弹状病毒,RABV-G(病毒表面糖蛋白)是RABV诱导机体产生抗体的唯一抗原,利用基因工程技术可获得重组RABV-G蛋白(rRVGP)的亚单位疫苗,并制备相应的单克隆抗体。回答下列相关问题:
(1)在国内外研究中,rRVGP已经在多种细胞系统中实现了合成。在昆虫细胞系统中获取疫苗过程如下:
①提取病毒的RNA进行RT-PCR,即将病毒RNA经过______过程获得cDNA,并对cDNA进行PCR扩增。RT-PCR过程中需要加入的酶有______
②利用______进行核酸分子杂交或利用______技术鉴定PCR产物以检测是否获得正确的目的基因。
③待用②中后者方法鉴定结束后,用刀片切割______并回收目的基因,从而达到提纯的目的。 接着将纯化得到的目的基因与特定质粒酶切连接,再利用______法将重组DNA分子导入果蝇S2细胞,待表达后破碎细胞,最后利用______技术对rRVGP进行检测。
(2)2023年诺贝尔生理学或医学奖颁布给了两位在mRNA疫苗上做出突破性贡献的先驱。在狂犬病的预防中,同样也可以使用mRNA疫苗,但缺陷是机体缺少______(填“RNA聚合酶”或“DNA聚合酶”),使得mRNA进入细胞后不能在体内持续产生大量抗原,且mRNA在体内容易被降解。对此研究人员研制出一种自扩增RNA(saRNA)疫苗,即在mRNA中加入一段可复制的序列,并对mRNA5'端加帽,3'端加尾部修饰,使其能在机体内稳定存在。相比于传统的mRNA疫苗,saRNA疫苗还具有的优点是______
(3)RABV-G的单克隆抗体制备及鉴定。过程如下:
①将RABV-G作为抗原对小鼠多次注射后,从脾脏中分离出小鼠的B淋巴细胞与可以______的骨髓瘤细胞融合,并利用选择培养基对融合细胞进行筛选。
②对筛选后的细胞进行______培养和抗体检测,最后获得所需的杂交瘤细胞。
③将获得的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养或体外培养获得单克隆抗体。
(4)除了利用细胞融合技术制备单克隆抗体,还可以利用转基因动物乳腺生物反应器生产单克隆抗体。过程如下:
①体外获取单克隆抗体的基因后,将该基因插入到乳腺细胞特异性表达的乳清酸性蛋白(WAP)基因组中,为减少后续分离单克隆抗体的难度,可对原WAP基因进行______,但必须保留原有的启动子和调控序列,且插入的位点在调控序列下游,以保证基因的正确表达。
②将上述重组基因导入哺乳动物细胞,通过同源重组技术获得经转化的细胞。
③将符合要求的细胞的细胞核植入_____,从而形成融合细胞。将融合细胞进行______,一段时间后植入雌性动物代孕体,直到母体分娩出转基因动物。
④待个体长大后,从乳汁中分离纯化RABV-G单克隆抗体。

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【推荐1】 IKK 激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成,该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKβ基因编码区第1183位碱基T突变为C, 导致IKKβ上第395 位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出 SCID 模型小鼠,主要过程如下图1、2。

(1)在PCR反应体系中,需要加入引物和IKKβ基因外,主要还需要加入______________等。可以通过_______________来初步鉴定PCR产物,还可将含有_____________的凝胶切割下来回收凝胶中的DNA,进一步通过 DNA 测序技术鉴定PCR产物。
(2)在图 1 获取突变基因过程中,需要以下 3 种引物:
引物A: 5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'(下划线字母为突变碱基)
引物 B:5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'(下划线部分为限制酶 HindIII识别序列)
引物C: 5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'(下划线部分为限制酶SacI识别序列)
上述三种引物中,在PCR1中使用的引物有__________________________,在PCR2中使用的引物有_____________,PCR2中另外一种引物是图中大引物的_____________(填“①”或“②”)链。
(3)图2模型鼠培育过程中杂合模型鼠(F₀)的培育涉及了一系列现代生物技术,下表是其中的一些步骤,请根据题意完成表格内容。
过程实验目的步骤要点
导入a.处理突变基因与载体①利用限制酶________(填“HindIII”、“SacI”、“HindIII和SacI”)处理突变基因和载体
b.构建重组载体利用DNA连接酶催化突变基因和载体连接
c.导入目的基因②通常利用________法将重组DNA导入小鼠受精卵
发育d.胚胎体外培养利用专用培养液培养受精卵,并检测其发育状况
e.代孕获得小鼠③选择体外培养至________,植入代孕母鼠子宫角,直至小鼠出生
f.鉴定、筛选F0小鼠利用PCR鉴定基因,筛选出杂合鼠F0

(4)图2所示的F0小鼠若要在胚胎时期就确定其性别,则可取_____________细胞,进行_____________分析来判定。根据图2杂交结果,可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的染色体上,在遗传时遵循_____________定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳,结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制:_____________
2023-12-24更新 | 391次组卷
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名校
【推荐2】胰岛素作为治疗糖尿病的特效药,市场潜力巨大,科学家利用转基因技术获得转入胰岛素基因的大肠杆菌,通过发酵工程,实现胰岛素的大量生产。图1表示人胰岛素基因与引物位置、限制酶作用位点,图2表示所用质粒的结构。
据图回答以下问题:
   
(1)若要扩增出胰岛素基因并用于表达载体的构建,应选择的引物是__________。若要得到可用于构建表达载体的目的基因,至少经过_____次循环。
(2)构建基因表达载体时,最好选择限制酶_____,原因是_____
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时,需用_____处理大肠杆菌,其目的是_____
(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来,甲同学在加入氨苄青霉素的培养基中进行接种,结果如下图:

   
该同学采用的接种方法是_____。乙同学认为该结果得到的菌落并不都是成功导入重组质粒的大肠杆菌,你认为乙同学判断的理由是_____
请在甲同学实验结果的基础上提出一种思路,将导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来:_____
2023-07-02更新 | 185次组卷
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【推荐3】血栓对健康有极大危害。来源于金黄色葡萄球菌的天然葡激酶(SAK)是一种新型溶栓制剂,因易诱发免疫反应而严重限制了应用。人HC蛋白参与免疫抑制反应,对机体保护性的免疫调节有着重要作用。研究人员预测,将SAK与人HC蛋白融合形成的SAK-HC融合蛋白不仅能够发挥高效溶栓作用,且能降低机体免疫系统对葡激酶的反应,这将具有极大的临床应用前景。
(1)获取SAK-HC融合基因。设计引物分别扩增SAK基因和HC基因,其中HC基因的引物D中增加了一段与SAK基因相同的序列。SAK基因扩增时引物(F和N)位置如图1所示,请在方框内绘制出HC基因扩增的引物(D和R)位置____________。将得到的SAK基因和HC基因1:1混合,经再次扩增即可得到SAK-HC融合基因。

(2)利用____________酶将融合基因与质粒构建基因表达载体,转化经____________处理的大肠杆菌。筛选、培养大肠杆菌,提取质粒进行电泳分析(图2),结果显示融合基因已成功导入大肠杆菌,理由是____________,为保证检测结果的准确性,还应对重组质粒酶切的产物进行____________

(3)培养转化成功的大肠杆菌一段时间后,破裂细胞、提取纯化融合蛋白并用缓冲液稀释,进行活性鉴定。培养基中加入纤维蛋白原、纤溶酶原、凝血酶等模拟血栓形成,摇匀至浑浊立即倒平板,用打孔器在冷却的平板上打加样孔,并加入不同的样品,结果如图3。据图判断,表中a、b分别是______________________。一段时间后测量培养基上____________,若图3中1-6组透明圈直径大小接近,可知____________,说明融合蛋白具有进一步临床应用研究的价值。

加样孔

样品

剂量

1

传统溶栓药物尿激酶

10μL

2

传统溶栓药物尿激酶

20μL

3

a

10μL

4

a

20μL

5

其他方式改造的葡激酶

10μL

6

其他方式改造的葡激酶

20μL

7

b

20μL


(4)研究发现,葡激酶结构中的第77位精氨酸与T细胞对其识别有关。请设想新的研究思路改造现有葡激酶,以降低免疫反应,使其适于临床应用,写出基本流程____________
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