【推荐1】黄瓜花叶病毒能感染多种植物，对烟草的危害尤其严重。病毒的Cu-4基因表达所形成的蛋白是子代病毒形成和释放的关键蛋白。研究人员利用农杆菌转化法获得能表达Cu-4基因反义RNA的转基因烟草，反义RNA与Cu-4基因转录获得的mRNA互补结合形成双链RNA，阻止了mRNA的翻译，从而获得了抵抗该病毒的能力。在Cu-4基因（A链是模板链）一侧连接了带有细菌启动子的四环素抗性基因（在植物细胞该基因会被完整切除），如图1所示。图2是Ti质粒相关基因图谱。

备注：
Cu-4基因长度为300bp，tef基因长度为500bp。I-IV是四种引物。
LB和RB是T-DNA的界，EcoRⅠ和XhoⅠ是两种限制，切割后形成的黏性末端不互补。
P_35S和Tkc是仅在植物细胞中发挥功能的启动子和终止子。tet'和amp'分别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。所用农杆菌不具有氨青霉素，四环素和潮霉素抗性。
(1)人工合成如图1所示的DNA片段后，利用引物组合___________（A.引物I和IV；B.引物Ⅱ和Ⅲ；C.引物I和Ⅲ；D.引物Ⅱ和IV）进行PCR扩增，为使图1所示的DNA片段能与载体正确连接，在引物的5′端分别添加__________酶的识别序列，将Ti质粒导入农杆菌后，可使用含有__________的培养基进行筛选。
(2)在将农杆菌接种在烟草叶片前用砂纸轻微摩擦烟草叶片，目的是__________。接种一段时间后，将烟草叶片酶解，获取分散的叶肉细胞。将叶肉细胞培养在含有潮霉素的培养基中扩增培养，其中潮霉素的作用是__________。
(3)提取叶肉细胞的总DNA，酶切后用相应的PCR引物进行扩增，电泳后若观察到长度__________的片段，则说明所需的基因导入植物细胞中。
(4)将具有黄瓜花叶病毒抗性的烟草进行自然种植时，需考虑转基因作物的安全性问题。研究人员发现将目的基因转移到植物细胞线粒体或叶绿体中可降低基因漂移发生的风险，原理是__________。

【推荐2】动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有效的细胞培养。该系统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表达载体，然后将该重组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白，相关过程如图所示。回答下列问题：

   

(1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。
①实验人员提取了相关mRNA，通过逆转录获取cDNA，再通过PCR技术扩增人乳铁蛋白基因。在整个过程中，需要用到的原料是__________。
②实验人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA聚合酶，而不能使用普通的DNA聚合酶，其原因是__________。
(2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI及其酶切位点，Tet^R表示四环素抗性基因，Amp^R表示氨苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是__________，同时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和___________之间。
(3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为__________。
(4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C三头转基因牛的乳汁，从中提取了蛋白质，结果发现A、C两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B转基因牛提取的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。该检测方法的原理是__________。进一步提取A、C两头转基因牛的基因组DNA和mRNA进行检测，A转基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C转基因牛则都不能检测到。以上两次检测结果说明了___________。

【推荐1】某研究团队从沙漠野生柽柳中克隆出了一个耐盐碱基因TcSR1。该团队用限制酶切割目的基因TcSR1，用限制酶BamHⅠ切割质粒载体V3，两种限制酶的识别序列及酶切位点如图所示，经过体外重组和转化，最终获得了能够在盐碱地生长的杨树新品种。回答下列问题：

(1)使用______技术在体外扩增耐盐碱基因TcSR1，扩增时需要______种引物。基因TcSR1不直接导入杨树细胞，原因是____________(答出两点即可)。
(2)用限制酶BalⅡ切割目的基因和用限制酶BamHⅠ切割质粒载体V3后，再用______________酶处理，以构建基因表达载体，该表达载体不能够被BalⅡ或BamHⅠ识别并切割，原因是_______________________。
(3)将目的基因导入杨树细胞，培育后筛选转化阳性的植株。若要检测杨树植株中目的基因TcSR1是否发生转录，可采用_____技术，需要将______________片段制成探针，通过检测放射性达到目的。
(4)为进一步研究转基因杨树的耐盐碱机制，还需要进一步开展研究，实验思路是通过_________技术获得大量转基因植物，然后________________。