【推荐1】海洋石油污染正引起广泛关注，利用基因工程菌进行生物降解具有巨大的应用潜力。P450是石油降解的关键酶，用SalI和NdeI联合酶切获得的P450基因，与甲图所示的质粒（pCom8）重组，导入土著菌种Y9，获得了基因工程菌P450/Y9。甲图中mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的菌落变成黑色，aac Cl是庆大霉素（一种抗生素）抗性基因，限制酶NdeI、XhoI和SspI在原质粒上均只有一个酶切位点，数字表示酶切位点间的碱基对数。乙图表示几种限制酶的识别序列和切割位点。

（1）SalI切割目的基因形成的黏性末端是______。
（2）原质粒需用限制酶______作用后，才能与______在DNA连接酶作用下形成重组质粒。
（3）经测定原质粒为7.6kb（1kb为1000个碱基对），重组质粒经NdeI、SspI联合酶切后获得了6.0和1.2kb的两个片段，则目的基因的长度为______kb。
（4）由于重组质粒导入受体细胞的成功率很低，所以需要经过筛选才能获得工程菌。操作的大致思路是：
第一步，配制培养基。除了微生物生长所需的营养物质和琼脂外，还必须添加______。
第二步，待检菌液用______法接种在第一步配制的培养基上。
第三步，选择______色菌落扩大培养即可获得所需的工程菌。
（5）为检测基因工程菌降解石油的能力，科研人员做了如下4组实验，测定不同时间各组的石油降解率，实验结果见右图。

A组：单独使用Y9
B组：单独使用P450/Y9
C组：联合使用Y9、W3、F9、X1四种菌种
D组：联合使用P450/Y9、W3、F9、X1四种菌种。据图分析以下说法正确的是______（填序号）。
①单独使用P450/Y9对石油的降解能力比单独使用Y9略强
②作用时间越长，P450/Y9对石油降解的能力越强
③联合使用时，P450/Y9能显著增加四种菌的整体降解石油的能力
④为达到更好的效果，最好单独使用基因工程菌P450/Y9

【推荐3】菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。请据图回答下列问题：

（注：卡那霉素抗性基因Kan^R为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感）
（1）质粒是基因工程中最常用的载体，其化学本质是__________。
（2）限制酶M和N（如图）切割后产生的相同黏性末端是____________，连接它们所需要的基本工具是_______________。

（3）为了促进对重组质粒的吸收，可用____________处理土壤农杆菌，使其处于感受态。
（4）将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及__________的固体培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。
（5）用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据抗虫基因（目的基因）两端的部分碱基序列设计特异引物，若其中一种引物共用了31个，则目的基因最多扩增了______次。
（6）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如表所示。请据表回答:

①对照组应饲喂__________________________与人工饲料混合物。
②实验结果显示__________________________差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

【推荐1】科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌工程菌，成为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如图1所示，天然大肠杆菌不具备图1中所示基因。

(1)在上述研究中，需导入天然大肠杆菌的目的基因有________。（选填序号）（多选）
①四环素合成相关基因 ②GFP 基因 ③TetR基因 ④RNA 聚合酶基因
(2)基因工程中最核心的步骤是________，其目的是________。
(3)据图1，当环境中不含四环素时，该大肠杆菌工程菌________（选填“能发出”“不发出”）荧光；环境中四环素水平越高，该种大肠杆菌工程菌的荧光________（选填“增强”“减弱”“不变”）。试概述该种四环素检测方法的原理：________。
(4)图2是2个DNA片段、质粒及其上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布情况；其中质粒上的Amp^r代表青霉素抗性基因。表为相关限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点。

限制酶	EcoRI	XbaI	SpeI	BamHI
识别序列及切割位点

则，BamHI酶切后产生的黏性末端为________。若要拼接DNA片段1和2，结合图2和上表中信息，在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为________。（选填下表中序号）

编号	①	②	③	④
拼接位点处的碱基序列

(5)研究人员设计了一个同时含DNA片段1和2的重组质粒的拼接方案，结合图表信息，你认为最终建构成功的重组质粒示意图最合理的是__________。

(6)下列操作能够证明重组质粒和大肠杆菌工程菌建构成功的方法及现象有         。

A．通过琼脂糖凝胶电泳实验证明重组质粒的大小符合预期

B．大肠杆菌工程菌不能在含有青霉素的培养基上生长

C．用显微镜观察重组质粒上的外源 DNA 片段的碱基序列

D．四环素浓度变化能引起大肠杆菌工程菌荧光强度的相应改变

(7)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP的第65位丝氨酸突变成苏氨酸后，增强了绿色荧光稳定性和强度。该项技术属于_________。
①细胞工程   ②蛋白质工程   ③基因的定点突变

【推荐2】α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β和γ环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和 89 位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt催化特异性提高了27倍。

(1)重叠PCR是常用的 DNA定点突变技术，其原理如图所示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR不需要用到_______酶。要完成两处位点的突变，至少要设计________种引物。图中第1对和第2对引物的PCR产物混合、变性、退火后可形成①②两种产物，其中产物①_________（能/不能）延伸，原因是_____________________________________________。
(2)如图是该酶编码（非模板）链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸到赖氨酸（仅以密码子是AAG为例）的引物 FP2和RP1________________和_________________（只写371位到373位对应的9个碱基序列，并标出5'端和3'端）。

(3)上述过程需要用到____________工程。用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题，主要是因为大肠杆菌缺少________________（填细胞器）。成功获得工程菌后，还须对获得的α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt） 进行活性检测，这是属于____________水平的检测与鉴定。

【推荐3】回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与黄酒制作有关的问题：
氨基甲酸乙酯（EC）作为一种潜在致癌物，广泛的存在于发酵食品和酒精饮料中。在各种发酵酒中，黄酒面临的EC超标问题更为突出，利用酸性脲酶消除其前体物质尿素被认为是最为有效的一种方法。
(1)获取含有酸性脲酶菌的土样，加入_____________制备成土壤悬液，并对土壤悬液中的酸性脲酶菌进行广大培养。从适合使用的角度分析，该酸性脲酶菌应对富含__________的发酵液有很好的耐受性。
(2)常用于分离菌种的方法是_________，经过酸性培养基的初筛培养后，还要在添加酚红的中性固体培养基上进行复筛，应该挑选_____________ （填“有红色圈的菌落”或“无红色圈的菌落”）为目标菌株，最后将其接种在_____________中，4℃冰箱中保藏。
(3)酸性脲酶菌的产酶能力受到许多因素影响，除培养基的营养成分、温度、pH外，在摇床培养时还应考虑__________________________。
（二）德尔塔变异毒株已成为全球新冠肺炎传播的主要变异株，我国研究团队最新发现针对德尔塔变异株有效的单克隆抗体。该抗体在新冠肺炎的短期预防与早期治疗上有较大的应用价值。图1表示制备该抗体的实验流程。回答下列问题：

(4)丙操作指的是_____________，甲中含有_____________种两两融合的细胞。
(5)乙中可以获得_____________的杂交瘤细胞。
(6)利用小鼠制备的单克隆抗体，在给人体使用时，可能会被人体免疫细胞清除，影响抗体的作用效果。抗体的结构如图2所示，下列技术可以解决此问题：从杂交瘤细胞中提取编码鼠源单克隆抗体_____________（填“5区”或“6区”）序列的基因，与从人体中获取的编码抗体_____________（填“5区”或“6区”）序列的基因，进行拼接，然后导入骨髓瘤细胞中，进行培养获取新的抗体，改造过程涉及_____________技术和_____________技术，这过程属于_____________工程。
(7)近期奥密克戎变异株确诊案例大幅增加，传播能力强，潜伏期更短，得过新冠和已打完疫苗会重复感染新冠，这可能是因为病患体内已产生的_____________减少或消退，加上奥密克戎毒株可能出现了新的抗原特征，具备部分免疫逃脱特性。

【推荐1】2021年12月8日，中国国家药监局应急批准腾盛华创医药技术（北京）有限公司新冠病毒中和抗体联合治疗药物安巴韦单抗注射液（BRII-196）及罗米司韦单抗注射液（BRII-198）注册申请，是中国全自主研发的单抗，联合用于治疗新型冠状病毒感染患者，效果显著。结合所学生物知识，回答下列问题：
(1)制备新冠单克隆抗体时，可以将新冠抗原注入不同人体内，下表表示免疫次数和抗体效价（每分子抗体能结合抗原的数量）之间的关系，若血清抗体效价需达到1:4000以上，则人体要至少要经过_______次免疫才能符合要求，第一次免疫和第二次免疫时，人体内能产生新冠抗体的细胞分别是由_______________________增殖分化形成的。

	A	B	C	D	E
第一次	1：1000	1：1000	1：1000	1：1000	1：1000
第二次	1：2000	1：2500	1：3600	1：2200	1：3000
第三次	1：4000	1：4600	1：8000	1：5000	1：4500

(2)制备新冠单克隆抗体过程中，涉及的技术原理是____________________________，专一抗体检测阳性和克隆化培养的目的是_______________________________，培养动物细胞的四个基本条件有适宜的温度和pH、营养、____________________________________。
(3)新冠单克隆抗体能准确的结合新冠病毒，这主要是因为单克隆抗体具有______________（答两点）的优点。
(4)骨髓瘤细胞和浆细胞融合一般可用灭活（灭活是指________________________________）的病毒或PEG作为诱导剂，融合效果受pH的影响，某实验小组为了探究PEG诱导细胞融合的最适pH，在pH为1〜8之内设置了系列等梯度的pH，发现随着pH的上升，细胞融合的效果越来越好，请你做补充实验，以达到该实验小组的实验目的。____________________________________。

【推荐2】狂犬病病毒的核酸是RNA，G蛋白和N蛋白是狂犬病病毒的主要抗原，它们刺激人体后可诱导入体产生相应的抗体和细胞免疫反应。下图表示用生物工程制备抗狂犬病病毒单克隆抗体的过程。请回答下列问题。

（1）制备该单克隆抗体的技术属于生物技术的细胞工程。图中细胞1是向小鼠体内注入________后而获得的______细胞，细胞2为_______细胞。细胞1具有产生______的功能，细胞2的突出特点是________。诱导细胞1和2融合的方法很多，常用的诱导因素有聚乙二醇、________、电激等。
（2）若细胞1基因型为HH，细胞2基因型为SS，在两两融合后的众多细胞中，基因的组合类型可能有_____。（填基因型）
（3）培养液的配方通常含有糖、氨基酸、无机盐、微量元素等，与植物细胞培养基有所不同的是，还含有_____。细胞在培养瓶中贴壁生长，随着细胞的增多，需要定期用_____使细胞从瓶壁上脱离下来。

【推荐3】新冠病毒外壳中的S蛋白具有很强的抗原性，S蛋白与人细胞膜上ACE2受体结合后入侵人体细胞，导致人体患肺炎。2021年12月8日，我国首个抗新冠病毒特效药——安巴韦单抗/罗米司韦单抗联合疗法特效药获得中国药监局的上市批准，这标志着中国拥有的首个全自主研发并证明有效的抗新冠病毒抗体特效药正式问世。回答下列问题：
(1)制备抗S蛋白单克隆抗体时，为获得大量免疫过的小鼠B淋巴细胞，可采取的措施是______。诱导小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合时，采用的诱导方法有______（答出两种即可）。
(2)经选择培养的杂交瘤细胞，还要进行______和抗体检测，经过多次筛选，才能获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。在体外培养杂交瘤细胞时，需通入95％空气＋5％CO₂的混合气体，其中CO₂的主要作用是______。培养过程中为防止杂菌污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的______。
(3)医学上常用双抗体夹心法定量检测S蛋白，该检测方法的基本原理如图：

①为实现定量检测目的，固相抗体和S蛋白的结合部位应与酶标抗体和S蛋白的结合部位______（填“相同”或“不同”）。
②该检测方法中，酶标抗体的作用是______、______。
(4)抗S蛋白的单克隆抗体能准确诊断出某人是否感染新冠病毒，原因是______。诊断某人是否为新冠肺炎感染者，还可采用核酸检测。若某人已经确诊为新冠肺炎的重症患者，除注射抗S蛋白的单克隆抗体外，还可以注射已康复患者的______以达到治疗该病的目的。