【推荐1】甜柿鲜果肉中含有可溶性糖、微量元素、维生素和β一胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者的喜爱。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关， 推测涩味程度可能与PDC 基因的表达情况有关。为筛选PDC 基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题。

(1)启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，同时启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响了基因的_______________水平。
(2)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组 DNA 进行酶切，然后在_______________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC 基因的上游，根据接头片段和 PDC基因编码序列设计引物进行_______________扩增，在扩增过程中使用的DNA聚合酶具有_______________的特点，在该酶的作用下可以将4种脱氧核苷酸加到引物的一端。
(3)AD基因表达出的 AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含__________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒 G 中的位点__________（填序号 1～5）作为cDNA 的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
(4)重组酵母Y1H 与Y187 能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有_______________的培养基中生存，则推测待测蛋白是 PDC基因的调控蛋白。
(5)筛选出 PDC 基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于__________工程，该工程的起点是________________________。

【推荐3】某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
   
(1)α链的3’端在________（填写“左侧”或“右侧”），A、B、C、D四个短核苷酸链，可作为PCR复制过程中的引物对的是________假设最初有m个供体DNA，若错选了另一对做引物，在进行n轮复制之后，理论上最终得到的DNA个数是_________，消耗的引物个数是________。
(2)PCR扩增得到的P基因（PCR时已在引物两端添加限制酶识别序列）经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图乙所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列，ATG对应其正常转录mRNA中的AUG（起始密码子）。
①根据图像可知PCR得到P基因时，与β链配对的引物________（填写“5’端”或“3’端”）相连的限制酶序列是_________________（按3’→5’填写碱基顺序）。
②将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，P基因对应的氨基酸序列与蛋白P不同，据图分析，不同的原因是_______________________。
   
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图丙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丁所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC。
   
图丁的①②③④⑤，其中______________（填写序号）存在与FLAG抗体介质结合的物质。其中②③中的物质与FLAG抗体和UBC抗体均能结合，两者之间的差异说明_________________________。通过___________组，可以分析缺失序列△的作用，该序列缺失造成的影响是___________________。

【推荐1】科学家将C-Myc（原癌基因）、KI4（抑癌基因）、Sox2和Oct4等四种关键基因利用病毒转入高度分化的小鼠成纤维细胞内，获得iPS细胞，iPS细胞在适当的诱导条件下，可以定向分化成各种细胞。
(1)利用成纤维细胞获得iPS细胞的过程中，转入c-MyC、KIf4、Sox2和Oct4等的作用是______。iPS细胞的分化程度与______干细胞最接近。题目中所运用的病毒与诱导动物细胞融合时使用的病毒除种类可能不同外，还存在一个明显的区别是______。
(2)在培养过程中，iPS细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单层，这种现象称为______；若需要进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理的原因是______。
(3)2019年科学家利用成纤维细胞→①开启（）基因/关闭（）基因iPS细胞→②开启（）基因/关闭（）基因→角膜细胞过程，制作出一层0．5毫米厚的“眼角膜”细胞薄膜，进行移植并获得成功。下表是在定向诱导培养细胞过程中，成纤维细胞、iPS细胞和角膜细胞的三种基因（FSP-1、SOX-2、K12）及其控制合成的蛋白质的情况。结合表中信息，①和②过程中三种基因开启/关闭的情况分别为：①______，②_______。

	FSP-1		SOX-2		K12
	基因	蛋白质	基因	蛋白质	基因	蛋白质
成纤维细胞	+	+	+	-	+	-
iPS细胞	+	-	+	+	+	-
角膜细胞	+	-	+	-	+	+

【推荐2】人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory syncytial virus,HRSV)是一种单链 RNA病毒，下图是构建人呼吸道合胞病毒基因组载体的示意图，相关限制酶的识别序列及切割位点为：BclI(T↓GATCA)、 EcoR1(G ↓AATTC)、 XbaI (T↓CTAGA)、 Sau3AI(↓GATC)、 BamHI(G↓GATCC),请据图回答：
   
(1)HRSV的基因组为-RNA,入侵细胞后在______________的催化下合成+RNA。被HRSV侵染的人体组织中易观察到“多核细胞”的现象，请解释此现象的可能成因_____。此现象被科学家发现并应用于____________（技术）。
(2)在RT-PCR中添加的某逆转录酶能实现从单链RNA到双链cDNA的合成过程，试推测该逆转录酶具有____________（①依赖于RNA的DNA聚合酶活性②RNaseH(RNA酶）活性③依赖于DNA的DNA聚合酶活性)等多种活性。HIV的逆转录酶还有DNA内切酶活性，试推测这可能与HIV侵染后____________（生理过程）有关。
(3)过程③需要用____两种酶切割质粒A。过程②设计引物时在两种引物的5'端分别添加____两种酶的识别序列，酶切位点一般不能添加在引物的3'端的主要原因是______。
(4)为制备减毒突变株，科研人员将单个突变碱基引入HRSV基因组cDNA质粒克隆中，流程如下图。已知在细菌体内合成的DNA分子有甲基化修饰，通过PCR扩增的DNA链无甲基化修饰。

   
①DpnI识别甲基化的GATC四个碱基序列，因此其能将图中的_____链水解消化掉，以留下带突变碱基DNA链，其上缺刻（缝隙）在大肠杆菌细胞内完成的修复需要_____酶。
②若已知质粒B为a个，经过程①扩增15个循环，需要突变引物_____个，将过程②形成的产物全部转入大肠杆菌后复制n轮，得到双链突变的DNA______个。

【推荐3】乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。研究者将人工合成的、来源于牛的乳酸脱氢酶A基因（LDHA）插入酿酒酵母表达载体pAUR123中，经过转化、筛选、鉴定和培养，获得了产乳酸的商用酿酒酵母菌。回答下列问题：
(1)LDHA的获取
研究者从基因数据库检索获得牛LDHA编码序列为1170bp，并将其编码起始密码子序列中的原核生物偏好的GTG替换为酿酒酵母偏好的密码子ATG，替换的目的是___。再通过___法将核苷酸按照顺序一个一个连接起来，由此合成少量LDHA，为了获得大量的LDHA，可采用PCR技术对LDHA基因进行扩增。为了保证扩增过程的特异性，根据LDHA的两端序列设计相关引物。为了方便目的基因与质粒的正确连接，通常在引物1和2的5’端分别加上___（填限制酶）识别序列。

(2)pAUR123重组表达载体构建与扩增。
将LDHA和酿酒酵母表达载体pAUR123同时进行酶切，然后用DNA连接酶连接，得到重组的pAUR123表达载体，转化___大肠杆菌，待其恢复至正常状态后再接种于LB___（填物理状态）培养基中，于摇床上振荡培养，扩大培养大肠杆菌的目的是___。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此pAUR123重组表达载体上的乳酸脱氢酶编码序列___（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
(3)转LDHA基因酿酒酵母细胞的制备。
①将扩增的pAUR123重组表达载体和不能合成尿嘧啶的酿酒酵母细胞悬液混合，水浴一段时间，转化后的细胞稀释涂布于___的固体培养基表面，将培养皿倒置，置于30℃恒温箱培养48小时。挑取单菌落进行PCR，PCR体系配方中的酵母菌悬液起到___的作用，扩增出的pAUR123重组表达载体经过酶切、电泳，初步确定转LDHA基因酿酒酵母菌株。
②将目的条带大小正确的菌落质粒进行___，经与基因数据库中序列比对，进一步确定得到正确的转基因酿酒酵母细胞。
(4)转LDHA基因酿酒酵母发酵产乳酸能力检测。
将___分别接种于液体培养基中，进行连续培养，定时采用血细胞计数板在显微镜下计数细胞密度，并测定___，结果表明转基因酿酒酵母获得产乳酸能力。
(5)商业化生产。
与传统的乳酸菌发酵产生乳酸相比，利用转LDHA基因酿酒酵母菌产生乳酸，生产发酵罐中接种的菌种量可以更___（多/少）。

【推荐1】磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。

(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿______________的方向水解DNA，其目的是形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是______________（每空1分）。
(2)过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是______________，过程③所需的酶有______________。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有_______________。

A．不受限制酶切位点的限制

B．不会引入多余碱基

C．操作时间短，成功率高

D．有利于多个小片段（小于50bp）连接

(4)PCR扩增PABD基因时需依据______________设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的______________。

1	5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3'
2	5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3'
3	5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3'
4	5'-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3'

(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有______________的MS培养基上进行筛选和鉴定；通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______________，了解PA的动态变化。

【推荐2】口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VPI。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图1所示。图2表示目的基因与pZHZ1质粒构建重组质粒的过程，E、F、G、H分别为A、B、C、D四种不同限制酶的酶切位点。请据图回答。

⑴口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，要获得VPI基因可通过___方法获得。
⑵如图2所示，若限制酶A、B切割出的末端完全不同，那么用这种双酶切的方法构建重组质粒的优点是___。
⑶已知质粒pZHZ1的长度为3.7kb，（1kb=1000对碱基)其中EF区域长度为0.2kb，GE区域长度为0.8kb，FH区域长度为0.5kb。现分别用限制酶G、H切割重组质粒pZHZ2样品，结果被酶G切割成1.6kb和3.1kb两个片段，被酶H切割成1.2kb和3.5kb两个片段。据酶切结果判断VPI基因大小为_____ kb，并将目的基因内部的酶G、酶H切割位点用相应的字母标注在答案纸的对应位置____。
⑷过程⑥的培养基中除了加入各种必需营养物质和____等激素外，还需要添加____筛选出含有重组质粒的叶片小段。
⑸获得表达VPI蛋白的番茄植株以后，需要进行免疫效力的测定。具体方法是：将转基因番茄叶片提取液注射到豚鼠体内，每半个月注射一次，三次后检测豚鼠血液内产生的___的数量。

【推荐3】科学家尝试使用Cre/loxP位点特异性重组系统，在检测目的基因导入成功后，删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因。其技术过程如下（图中的■代表基因前的启动子），据图回答：

（1）loxP是一种只有34个碱基对构成的小型DNA片段，是有两个13个碱基对反向重复序列和中间间隔的8个碱基对序列共同组成，自身不会表达，插入质粒后也不影响原有基因的表达，其碱基序列如下：

Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的_____________酶。从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒产生的结果相当于可遗传变异中的_____________。
（2）将重组质粒导入到植物细胞中最常用的方法是_______________________。基因表达载体的基本元素有_____________、_____________、_____________和_____________。作为标记基因，抗除草剂基因用于检测目的基因是否导入成功的原因是_____________。
（3）经检测成功后，抗除草剂基因己没有用途，继续留在植物体内可能会造成的安全问题是________。经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开后，可得到如上图右侧的这两个DNA分子。由于_____的原因，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。