【推荐1】利用基因工程的方法可以生产大量的胰岛素，下图是利用这一方法生产胰岛素的过程。请回答下列问题：

（1）胰岛素mRNA只能从胰岛细胞中获得，而不能从其他细胞中获得，这是因为_______________________________________________________。
（2）完成过程②所需的酶是______。过程③所利用的技术是______。
（3）过程④是____________，所用的工具酶有____________。
（4）将A导入大肠杆菌之前需要使用____处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌处于______态。
（5）检测目的基因是否成功导入大肠杆菌，可以采用______的方法检测。

【推荐2】启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。³⁵S启动子是组成型启动子，能够持续、高效地启动目的基因在植物各种组织中表达，但往往也会阻碍植物的生长发育；Rd29A启动子是一种逆境诱导型启动子。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达的载体，过程如下图。再利用农杆菌转化法转化“敖汉苜蓿”培育耐旱新品种，以期在干旱地区发展苜蓿产业。请回答下列问题：

限制酶	BclⅠ	SacⅠ	BamHⅠ	PstⅠ	SmaⅠ
识别序列切割位点	T↓GATCA	GAGCT↓C	G↓GATCC	CTGCA↓G	CCC↓GGG

注：neo^r是新霉素抗性基因，aadA是链霉素抗性基因。
（1）Rd29A启动子的基本组成单位是_________；能识别启动子的酶是_________。
（2）科研人员扩增Rd29A启动子所设计的引物如下，根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，构建载体2时选用的限制酶是_________。
上游引物P1:5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3'
下游引物P2:5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3'
（3）选用_________酶切割载体1、2，构建载体3的成功率较高。研究人员在保存目的基因AmDHN时，构建载体4导入大肠杆菌的优点有_________。
①稳定保存       ②准确复制       ③快速表达       ④方便取用
（4）载体5需先转入_________后再转化苜蓿，转化后应在培养基中添加_________筛选转化成功的愈伤组织。
（5）为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，挑选10株转基因植株，利用自来水和20%PEG（模拟干旱条件）处理8h，提取RNA通过RT-PCR检测AmDHN基因和MtActin基因（一种骨架蛋白基因）的表达水平，其结果如下图：

①选择MtActin基因转录水平作为参照的依据是MtActin基因在各种细胞中表达相对恒定。
②自来水处理和20%PEG条件下的AmDHN基因表达水平的差异说明_________。

【推荐3】引起人类肺炎的某病毒（nCoV）是一种单链RNA病毒，其跨膜表面糖蛋白（GP）是该病毒侵染宿主细胞的关键蛋白，科学家欲利用大肠杆菌作为工程菌批量生产GP以制备相关疫苗，已知Tet^r为四环素抗性基因，LacZ′基因的表达产物能使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色。下图为部分流程示意图（图中EcoRⅠ→为目的基因的插入点），回答下列问题：

(1)为了判断是否感染nCoV，利用探针对疑似患者进行核酸检测，要在短时间内大量快速生产探针可利用______________技术。从nCoV基因组中直接分离出的nCoV-GP基因不能直接与质粒连接进行重组，其原因是________________________，过程①用到的酶为_____________。
(2)过程②除了得到重组质粒外，还可能得到2种片段大小不一的产物，因此为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入 ______________，筛选___________（填“蓝色”或“白色”）菌落。
(3)若需要将这个质粒改造成基因表达载体，还需要插入__________和__________。为检测大肠杆菌是否表达出目标产物，可对大肠杆菌的总蛋白质进行提取，并通过__________________技术进行检测。

【推荐1】科研人员从云杉卷叶蛾越冬幼虫中分离出一种超强的抗冻活性基因sbwAFP，并导入番茄植株中，使番茄植株获得抗冻性，下图表示重组质粒的构建和筛选过程。请回答下列问题：（Amp^F为氨苄青霉素抗性基因，Tet^F为四环素抗性基因）

（1）对获得的sbwAFP基因通常用__________技术以扩增数量。分析图示，构建重组质粒时，应选择限制酶__________和______________切割目的基因和质粒。
（2）将重组质粒导入大肠杆菌前，应用_________处理大肠杆菌,以制备感受态细胞，为了筛选将重组质粒，可将大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，成功导入重组质粒的大肠杆菌在两种培养基的生长状况为__________________________________。
（3）将成功导入了目的基因的番茄细胞培育成完整植株幼苗所采用的技术是_____________，从细胞的角度分析，所依据的生物学原理是_____________________。
（4）如何从个体水平检测目的基因是否成功表达？__________________________。

【推荐2】细胞色素P450酶在菇类天然产物合成过程中起重要（羟基化）作用，自然条件下，P450酶与其伴侣蛋白CPR（为P450酶传递电子）在细胞内分别表达，催化效率较低。研究人员推测，若将P450酶与CPR通过一段linker（3-9个氨基酸组成的柔性肽链）融合表达成一个蛋白（如图），催化效率会有不同程度提高。请回答：

（1）首先从预期融合蛋白的功能出发，设计融合蛋白的结构，推测其_________________设计并合成相应的_____________。融合蛋白的表达顺序为CPR-linkerP450，设计时应将CPR基因的________________删除，保证融合基因连续表达。
（2）欲进一步探究linker长度对P450酶催化效率的影响，基本实验思路：_____________________________________，本实验还应设置的对照组是_________________________
（3）PCR技术扩增融合蛋白基因时，所遵循的原理是_________________，将模板DNA加热至90-95℃的目的是______________________.

【推荐3】TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法，其基本原理是PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。下面是TaqMan水解探针作用机理示意图。请回答下列问题：

(1)PCR的原理是_____。在反应体系中除模板外还需要添加的物质有_____，如果想要获得100个目的基因，在反应体系中加入2分子底物DNA的情况下，至少需要经过_____次PCR过程。
(2)从解旋过程进行分析，PCR扩增与体内DNA复制过程不相同的地方是_____（答出两点）。
(3)对新冠疑似患者进行核酸检测是目前最常用的检测手段，获得鼻拭子、咽拭子后，首先通过实时荧光定量PCR技术扩增目的基因片段，然后采用相应的DNA分子探针进行检测。此处的分子探针是_____，检测原理是_____。
(4)研究人员采用PCR技术可以获得大量目的基因，此外，获得目的基因的方法还有_____（答出两种）。
(5)PCR过程中Taq酶从5'端切断TaqMan探针，释放荧光基团。根据荧光强度可对PCR产物进行定量分析，原理是_____。

【推荐1】口服α—干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。请回答下列问题：

(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______。由于DNA复制时，子链只能由5'向3’方向延伸，故可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取______作为引物。

(2)步骤②用到的农杆菌Ti质粒的功能是：______。图示过程涉及的生物工程包括植物基因工程和______，后者利用了细胞______的原理。
(3)如果将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，早期胚胎培养至______阶段，然后进行胚胎移植，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为______。
(4)干扰素体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在－70℃条件下保存半年，给广大患者带来福音。对蛋白质进行改造，应该直接对基因进行操作来实现对蛋白质的改造。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过______或______，对______进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产或生活需要。

【推荐3】近日，我国首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白质——人神经生长因子（其对应的基因为hNGF基因）。该研究为生产高活性的人类药用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用，给人类健康带来了新的福音。请回答下列相关问题：
(1)为获得大量的hNGF基因，科研人员利用PCR技术进行了扩增，该技术又称为__________反应，该过程中需要设计两种引物，这两种引物之间应最好具备什么条件?__________。
(2)科研人员将获得的hNGF基因（目的基因）与__________启动子结合在一起，然后将表达载体导入到__________（填“雄性”、“雌性”或“雄性或雌性”）受精卵中，利用__________技术获得囊胚，欲获得更多相同个体，可利用__________技术。
(3)与乳腺生物反应器相比，唾液腺生物反应器的优点是__________（答出两点即可）。

【推荐1】在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，被广泛应用于奶酪和酸奶的生产。科学家将编码牛凝乳酶的基因（长度1.5kb）导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
(1)提取小牛胃黏膜组织中的mRNA，经逆转录得到cDNA，选择合适的引物进行PCR扩增，PCR引物碱基数一般在20～30个之间，过短则导致___。
(2)如表为操作过程中可能用到的限制酶，图1为获得的目的基因及末端（除黏性末端序列外，其他碱基序列省略），图2为要使用的质粒，其中的Tet^r、Amp^r分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。对质粒进行切割时，选用的两种限制酶为___。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是___，导入的目的基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是___。

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
识别位点及切割位点	—G↓GATCC—	—T↓GATCG—	—CCC↓GGG—	—↓GATC—

(3)已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序：___（用箭头表示）。
①重组DNA分子导入大肠杆菌
②随机改变凝乳酶基因的序列
③分析突变蛋白功能，设计结构
④改变凝乳酶基因的特定序列
⑤培养细胞后提纯突变蛋白
⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组

【推荐2】干扰素在人体中是由免疫细胞合成并分泌的一种糖蛋白，几乎能抵御所有病毒引起的感染。传统生产方法成本高，产量低，获得的干扰素在体外不易保存。用生物技术手段可以解决这些问题。请回答相关问题。
(1)利用基因工程生产干扰素，过程是：
①从健康人体外周静脉血分离能合成干扰素的免疫细胞，从中提取_____，经反转录获取目的基因，此过程需要的原料是_____。
②用限制酶处理载体和目的基因后，用_____酶处理，形成重组载体，该载体的化学本质是_____。
③若选择大肠杆菌作为受体细胞，常用的转化方法使用_____处理，使其成为_____，一定温度作用下完成转化。
④在培养液中培养一段时间后，离心后取_____（上清液/菌体），经进一步处理获得产物，进行产物鉴定时可采用_____技术。
(2)利用蛋白质工程对干扰素进行改造，基本途径是：
预期蛋白质功能→_____→_____→找到对应的脱氧核苷酸序列。
(3)利用细胞工程生产干扰素，思路是：
将相应免疫细胞和瘤细胞融合，筛选_____细胞，经细胞培养可获得大量干扰素。

【推荐3】胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，回答下列问题。

   

(1)新的胰岛素生产过程属于_____工程，该工程的操作对象为_____。
(2)获取新的胰岛素基因除图示方法外，还可以通过_____获得；在体外利用PCR技术对人工合成的新的胰岛素基因进行扩增时，需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶发挥作用的温度为_____℃左右。此过程还需要在反应体系中加入两种引物，引物的作用是_____。
(3)在大肠杆菌细胞中合成的新的胰岛素，需通过生化制备与重折叠才具备预期的功能，原因是_____。
(4)若想建立乳腺生物反应器大量生产胰岛素，需借助基因工程的方法，常以哺乳动物的_____为受体细胞。为了保证干扰素基因只在乳腺细胞内表达，构建表达载体时必须在目的基因的前端加上_____。