17. 蜂毒前溶血肽原是prepromelittin基因(以下简称PL基因)的表达产物,在蜜蜂体内合成后首先加工成蜂毒溶血肽原(蜂毒肽前体蛋白),被进一步水解形成分泌蛋白蜂毒肽。与蜂毒肽相比,蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度,且对细胞的破坏能力小,可利用基因工程方法合成蜂毒肽的前体产物。
(1)生产蜂毒肽常选用微生物做受体细胞,优点是
_____(答出两点即可);原核细胞
_____(填"能"或“不能")将蜂毒溶血肽原加工成蜂毒肽,原因是
_____。
(2)为了解决(1)中的问题,对蜂毒前溶血肽原基因进行改造(如下图1),以便后期用羟胺(一种能专一性裂解特定两个氨基酸之间肽键的化合物)对生产出的蜂毒前溶血肽原进行加工。根据图1推测羟胺的识别位点是
_____。为实现最终生产有活性的蜂毒肽,与原DNA序列相比,改造后的序列末端还删除了Gly的对应编码链序列
_______,推测删除的理由是
_____。改造后的DNA编码区序列长度为
_____bp
注:①阴影:蜂毒肽序列;方框:Asn-Gly位点;
②图1中所示的“原DNA序列”为蜂毒前溶血肽原的编码区序列的编码链;
③甲硫氨酸,缩写为M,由起始密码子AUG编码;丙氨酸(Asn),缩写为N;
④甘氨酸(Gly),缩写为G,由密码子GGU、GGC、GGA、GGG编码。
⑤终止密码子UAA、UGA和UAG
(3)根据改造后的基因序列,利用人工化学合成方法进行全基因合成,设计并合成引物对合成基因进行PCR扩增,引物序列的长度越长、GC含量越高,PCR过程中退火温度的设定值越
_____。将PCR产物和pGEX-4T-1载体利用酶
_____进行基因表达载体的构建,获得蜂毒前溶血肽原与GST(一种标签蛋白)融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMe.(见图2)。扩增PL基因时设计了引物对M1和M2,其中M1的部分序列是:5'-GAATTC-3'且EcoRI的识别序列是GAATTC,请续写出该引物的后8个碱基5'
_____3'。
(4)将重组表达载体转化至
_____(“含有”或“不含有”)pGEX-4T-1/PPMel的大肠杆菌的感受态细胞,借助PCR和电泳鉴定是否转化成功:凝胶中DNA分子的迁移速率与
_____有关(答2点)。
(5)若培育相应的转基因植物;常用农杆菌转化法,需将目的基因插入质粒的
_____中,最后通过植物组织培养技术培育转基因植株。