Cre/loxP酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。
(1)图1是利用Cre/loxP酶系统敲除基因的过程。loxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区。两个loxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是___________ ，敲除的基因片段会形成___________ （填“线状”或“环状”）结构。
(2)图2是利用Cre/loxP酶系统构建融合基因的过程。首先要用PCR对Bt基因和Bar基因分别扩增，以获得所需要的DNA片段，然后对连接后的DNA片段用Cre/loxP酶系统处理获得Bt-Bar融合基因片段。在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在____________ ；又有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5'末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5’端序列的要求是___________ 。
(3)图3是用Cre/loxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程。已知图中的启动子和终止子可在烟草细胞中正常发挥作用，Cre酶基因在环境中存在Tam化学物质时才能激活表达。重组Ti质粒中的Bar基因作为基因表达载体中的___________ 可对转化后的烟草细胞进行筛选。进行图3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正确表达，据图分析，原因是___________ ；若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，请利用Cre/loxP酶系统提出解决方案___________ 。
(4)图4是经过修饰后的转基因烟草细胞内的融合基因所在片段及相关引物的结合位点。为检测Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行鉴定：
实验组：首先提取在有Tam环境下培养的转基因烟草细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入引物1和引物2进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无Bt基因和Bar基因的条带。
对照组：用未进行敲除处理的转基因烟草细胞，其余同实验组。
若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为___________ 。
(1)图1是利用Cre/loxP酶系统敲除基因的过程。loxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区。两个loxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是
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(4)图4是经过修饰后的转基因烟草细胞内的融合基因所在片段及相关引物的结合位点。为检测Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行鉴定：
实验组：首先提取在有Tam环境下培养的转基因烟草细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入引物1和引物2进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无Bt基因和Bar基因的条带。
对照组：用未进行敲除处理的转基因烟草细胞，其余同实验组。
若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为
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更新时间：2023-03-23 10:30:50
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【推荐1】某XY型雌雄异体二倍体植物的花色由两对等位基因（A/a，B/b）控制，其中基因A和B分别控制红色和蓝色色素合成；两种色素同时出现时表现为紫色花，两种色素均不出现时表现为白色花。所有基因型的植株都能正常生长和繁殖，不考虑突变及染色体交换。为确定两对基因是否为伴性遗传，现用两株植物做亲本进行杂交实验，并将F1进行随机授粉，实验结果如下表所示。
(1)上述实验过程中不需对植株进行去雄处理，原因是_______ 。F2红花植株中纯合子所占比例为_______ 。
(2)根据实验结果可推知A/a位于常染色体上，判断依据是_______ 。
(3)某同学认为利用本杂交实验中的植株设计杂交实验，难以判断Y染色体上是否存在B/b基因，推测其依据是______ 。现有纯合的红花和蓝花群体，请以这两个群体做材料设计杂交实验判断Y染色体上是否存在B/b基因（要求：①只杂交一次；②仅根据子代雄株表型预期结果；③不根据子代性状的比例预期结果）。
实验思路：_______________ 。
预期结果并得出结论：_________ 。
(4)已知b基因是B基因中的一个C-G碱基对被A-T碱基对替换形成的。利用四引物扩增技术可对B/b基因进行检测，其原理是将四种引物同时加入DNA样品中进行PCR扩增，当引物3'末端碱基与模板链不能配对时，PCR的延伸过程难以发生。下图是该技术中B/b基因与四种引物位置关系的模式图（图中仅标出了与突变位点相关的碱基）。F1中红色雄性个体的DNA样本经四引物扩增后可得______ 种长度不同的大量DNA片段；若F2中紫色雄性个体的DNA样本经四引物扩增后可得______ 种长度不同的大量DNA片段，则说明B/b基因位于XY同源区段上。
P | ♂红 | ♀蓝 | ||||||
F1的表现型及比例 | ♂紫 | ♂红 | ♀紫 | ♀红 | ||||
1 | 1 | 1 | 1 | |||||
F2的表现型及比例 | ♂紫 | ♂红 | ♂蓝 | ♂白 | ♀紫 | ♀红 | ♀蓝 | ♀白 |
6 | 18 | 2 | 6 | 15 | 9 | 5 | 3 | |
(1)上述实验过程中不需对植株进行去雄处理，原因是
(2)根据实验结果可推知A/a位于常染色体上，判断依据是
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【推荐2】检测新型冠状病毒核酸特异性序列的方法最常见的是实时荧光逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）法。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针（如图1），其V末端连接荧光基团（R），3'末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答：
(1)结合图1和图2分析，因PCR反应模板仅为_____________ ，“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有__________ 酶、____________ 酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲体系等。
(2)若反应体系中存在靶序列，则TaqMan探针与____________ 结合，PCR反应时，___________ 酶沿模板利用外切酶的活性将探针酶切水解，放出游离的R和Q，R发出荧光信号。根据：TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据_________________ 。
(3)每扩增一条DNA链，就有_________ 个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越_________ 。
(4)虽然荧光RT-PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有_________ （填字母）。
a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足
b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染
c．病毒核酸关键序列发生突变
(1)结合图1和图2分析，因PCR反应模板仅为
(2)若反应体系中存在靶序列，则TaqMan探针与
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【推荐3】谷氨酸脱羧酶能以谷氨酸钠为前体产生γ-氨基丁酸，蛋白质复合物SNOI-SNZI能提高谷氨酸脱羧酶的活性。将谷氨酸脱羧酶基因gadB(1401bp)和基因SNOI(675bp) 、SNZI (894bp) 导入大肠杆菌， 以探究该复合物对其生产能力的影响。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体前，需先通过PCR 分别扩增目的基因片段，扩增反应体系应添加引物、模板、_____ 、缓冲液等，添加引物量不宜过多，原因主要是_____ 。
(2)表1 是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2是多种限制酶的识别序列和切割位点。构建重组质粒时，先将gadB 和 pTrc99a质粒(4176bp)分别用限制酶_____ 进行双酶切， 并连接得到重组质粒 pTrc99a-gadB。将基因 SNOI 和基因SNZI 分别连接到重组质粒 pTrc99a-gadB 上时， 均需用_____ (填限制酶)和DNA 连接酶处理，最终得到重组质粒 pTrc99a-gadB-SNOI-SNZI，如图1所示。
(3)采用电泳的方法对 pTrc99a 质粒、重组质粒 pTrc99a-gadB 和重组质粒 pTrc99a-gadB-SNO1-SNZI 进行鉴定。若构建成功， 用限制酶KpnI单酶切后电泳获得图2-A，则可推测泳道2是_____ 的电泳结果；用限制酶_____ 酶切后电泳可获得图2-B泳道3 结果。_____ 的大肠杆菌细胞中，分别获得菌株R1、R2、R3，培养后分别接种于含一定量_____ 的发酵培养基中，一段时间后测定γ-氨基丁酸含量。结果如图3所示。结果表明，与导入谷氨酸脱羧酶基因的菌株比，SNOI-SNZI基因的导入_____ 了其生产γ-氨基丁酸的能力，从能量代谢的角度分析，其原因有_____ 。
(1)构建基因表达载体前，需先通过PCR 分别扩增目的基因片段，扩增反应体系应添加引物、模板、
(2)表1 是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2是多种限制酶的识别序列和切割位点。构建重组质粒时，先将gadB 和 pTrc99a质粒(4176bp)分别用限制酶
表1 | ||
| 基因 | 引物1部分序列(5'→3') | 引物2部分序列(5'→3') |
| gadB | TCGCCCATGGCCATGATAAG | CTTCGGTACCTTAGGTATGT |
| SNZ1 | CTAAGGATCCGAAGGAGATA | CCTTCTCTAGATTACCACCC |
| SNO1 | TCGCGGTACCAAGGAGATAT | CTTCGGATCCTTAATTAGAA |
表2 | |
| 限制酶 | 识别序列 和酶切位点 |
| Xba Ⅰ | T↓CTAGA |
| Kpn Ⅰ | GGTAC↓C |
| Nco Ⅰ | C↓CATGG |
| BamH Ⅰ | G↓GATCC |
(3)采用电泳的方法对 pTrc99a 质粒、重组质粒 pTrc99a-gadB 和重组质粒 pTrc99a-gadB-SNO1-SNZI 进行鉴定。若构建成功， 用限制酶KpnI单酶切后电泳获得图2-A，则可推测泳道2是
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【推荐1】红景天中的HMA3基因能编码Cd转运蛋白，科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树，以实现栾树的定向改良，使其增强对Cd的富集能力，从而更有效治理Cd污染。实验的主要流程如下，其中Hygr为潮霉素抗性基因，Kanr为卡拉霉素抗性基因，请回答：
(1)重组质粒的构建、扩增、保存
① 从红景天细胞中提取总RNA为模板，进行RTPCR。其中PCR的反应条件：98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，其中55 ℃30 s过程称为________ 。若模板双链cDNA的数量为a个，经过35个循环需要消耗引物的数量是________ 。
② 为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质粒时用________ 酶切PCR纯化产物(已添加相应酶切位点)及Ti质粒，然后通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。
(2)栾树愈伤组织的诱导
切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加__________________ (填植物激素的名称)，放入培养箱，经过21 d的黑暗诱导，茎段经________ 形成愈伤组织。
(3)农杆菌介导转化体系的建立
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加________ 的培养基筛选出转化成功的愈伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。待幼苗长出较为发达的根系后进行移栽炼苗，炼苗的目的是_________ 。
(4)原生质体制备及目的基因的检测和鉴定
①取4 g筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含__________ 的酶解液中处理一段时间获得原生质体。
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是______________ 。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定，则可以检测比较转基因栾树与野生型栾树________ 。
(1)重组质粒的构建、扩增、保存
① 从红景天细胞中提取总RNA为模板，进行RTPCR。其中PCR的反应条件：98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，其中55 ℃30 s过程称为
② 为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质粒时用
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切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加
(3)农杆菌介导转化体系的建立
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加
(4)原生质体制备及目的基因的检测和鉴定
①取4 g筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是
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(0.4)
【推荐2】大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，部分结构如下图。在人体特定部位进行42℃处理后，p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达。据此回答下列问题：____ （填“启动子”或“终止子”），其功能是____ 。
(2)Tel42为来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac可以使Tel42持续性表达，当温度____ （填“低于”、“等于”或“大于”）42℃时，Tcl42蛋白会抑制启动子pRL。
(3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特定基因。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型aPD-L1蛋白基因（该蛋白可用于免疫治疗）等。请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路”→____ →重组酶Bxb1基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→____ →解除Tcl42蛋白对启动子pRL的抑制→____ →____ →细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。将下列选项代号填入上述横线，将“基因电路”补充完整。
A．受体菌37℃时
B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性
C．荧光蛋白GFP基因、aPD-L1基因的转录
D．重组酶Bxb1基因表达，进而引起p7两侧发生重组
(4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是____ 。导入后的菌体用____ 方法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。
(5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。请以成瘤建模后的小鼠为材料，设计一个实验方案____ 。
(2)Tel42为来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac可以使Tel42持续性表达，当温度
(3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特定基因。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型aPD-L1蛋白基因（该蛋白可用于免疫治疗）等。请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路”→
A．受体菌37℃时
B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性
C．荧光蛋白GFP基因、aPD-L1基因的转录
D．重组酶Bxb1基因表达，进而引起p7两侧发生重组
(4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是
(5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。请以成瘤建模后的小鼠为材料，设计一个实验方案
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【推荐3】四尾栅藻是一种微小藻类，具有环境适应能力强和生长速度快等优点，如果能将其进行品种改良，提高含油量，有望解决微藻生物柴油产业化进程的瓶颈。研究人员利用基因工程技术将油料作物紫苏DGAT1基因导入四尾栅藻，获得转基因的产油微藻，利用地热废水培养，不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。操作过程如下图，请回答下列问题：
注：①LacZ基因编码产生的酶可以分解物质X-gal，使菌落呈蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。②Xbal、BamHI、EcoRI和Smal为四种限制酶
(1)将质粒pMD19-DGAT1导入大肠杆菌前，通常先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种_____ 的生理状态。为了便于筛选含pMD19-DGAT1重组质粒的大肠杆菌，该选择培养基中应添加_____ 物质。在培养基中挑取_____ 颜色的大肠杆菌菌落可提取该质粒并获取目的基因。
(2)过程④需用到_____ 酶，既能构建重组质粒A又能避免自身环化问题。启动子是_____ 识别和结合位点，而且往往具有物种特异性，在载体pBI121质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择_____ （填“紫苏DGAT1基因”、“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）启动子。
(3)为了判断DGAT1基因是否导入四尾栅藻细胞，可利用PCR技术进行检测，已知紫苏DGAT1基因部分序列如下（左侧为基因的首端）：。
5'…CCGTGT……ATGCCT_____3'
3'…GGCACA……TACGGA_____5'
根据上述序列选择引物_____（填字母）进行PCR。
(4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。
该实验不能说明转DGATI基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计：_____ 。
注：①LacZ基因编码产生的酶可以分解物质X-gal，使菌落呈蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。②Xbal、BamHI、EcoRI和Smal为四种限制酶
(1)将质粒pMD19-DGAT1导入大肠杆菌前，通常先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种
(2)过程④需用到
(3)为了判断DGAT1基因是否导入四尾栅藻细胞，可利用PCR技术进行检测，已知紫苏DGAT1基因部分序列如下（左侧为基因的首端）：。
5'…CCGTGT……ATGCCT_____3'
3'…GGCACA……TACGGA_____5'
根据上述序列选择引物_____（填字母）进行PCR。
| A．引物：5'-GGCACA-3' | B．引物：5'-AGGCAT-3' |
| C．引物：5'-CCGUGU-3' | D．引物：5'-CCGTGT-3' |
| 指标 | 总氮（mg/L） | 总磷（mg/L） | 氟化物（mg/L） |
| 废水培养基 | 23．2 | 4．32 | 4．56 |
| 培养转基因四尾栅藻11天后 | 1．9 | 0．45 | 0．84 |
该实验不能说明转DGATI基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计：
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(0.4)
【推荐1】非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪和各种野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病。科学家研究发现，非洲猪瘟的病毒是一种双链DNA病毒，病毒表面的A蛋白为主要抗原。研制预防非洲猪瘟病毒疫苗简要的操作流程如下：
（1）科学家研制疫苗的理论依据是______________________
（2）要获得大量的A基因，通常采用PCR技术进行扩增，前提是要有一段已知的A基因核苷酸序列，原因是_______________________ 。在操作步骤中需要加热至90~95℃的目的是_______________________ 。
（3）步骤②所构建的基因表达载体中必需有标记基因，其作用是________________ 。为检测受体细胞是否合成A蛋白，可以采用__________________ 的方法。
（4）若要高效地获得A蛋白，通常选用大肠杆菌作为受体细胞。因为大肠杆菌具有___________________ （答出两点即可）等优点。在导入基因表达载体时常用____________ 处理大肠杆菌。
（1）科学家研制疫苗的理论依据是
（2）要获得大量的A基因，通常采用PCR技术进行扩增，前提是要有一段已知的A基因核苷酸序列，原因是
（3）步骤②所构建的基因表达载体中必需有标记基因，其作用是
（4）若要高效地获得A蛋白，通常选用大肠杆菌作为受体细胞。因为大肠杆菌具有
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【推荐2】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，包括以下几个环节：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。回答下列相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即____________ 和从生物材料中分离。如果利用某植物为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两者相比cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的__________ （多/少）。
（2）在构建基因表达载体时，经常使用质粒载体作为基因工程的工具，其应具备的基本条件有__________ （答出两点即可）。除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。启动子是__________ 酶识别并结合的部位。这一步骤中通常还会利用到DNA连接酶，常见的有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________ 。
（3）将目的基因导入受体细胞时，如果受体为植物细胞，采用最多的方法是__________ ，如果受体为动物细胞，采用最多的方法是__________ 。
（4）最后，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，经常采用的检测方法是_______________ 。
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即
（2）在构建基因表达载体时，经常使用质粒载体作为基因工程的工具，其应具备的基本条件有
（3）将目的基因导入受体细胞时，如果受体为植物细胞，采用最多的方法是
（4）最后，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，经常采用的检测方法是
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【推荐3】如图是我国利用基因工程的方法生产人生长激素的示意图。图中的质粒是基因工程中常选用的载体——Pbr322质粒，ampR表示青霉素抗性基因，tetR表示四环素抗性基因，限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ切割形成的末端均不相同。回答下列问题：
（1）人的生长激素基因能在大肠杆菌中表达的原因是______________________ 。构建基因表达载体是培育转基因生物的关键，基因表达载体中启动子的作用是_________________ 。
（2）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，切割质粒时应选用的酶是______________________ 。
（3）如果从限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ中任选两种酶对质粒进行切割，均会将质粒切成两段，则形成的DNA片段有________________ 种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段占______________ 。
（4）按照图示的操作，将三角瓶中的大肠杆菌先接种到甲培养基上，然后分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。据图分析丙培养基中含人生长激素基因的菌落有________ 个。
（5）将人生长激素基因导入小鼠体内来生产生长激素，应对供体雌鼠甲用促性腺激素处理一段时间后与雄鼠乙交配，然后通过手术的方法从雌鼠的________ 中取出受精卵。早期胚胎应保证发育到____________ 阶段，才能进行后续过程的操作。
（1）人的生长激素基因能在大肠杆菌中表达的原因是
（2）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，切割质粒时应选用的酶是
（3）如果从限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ中任选两种酶对质粒进行切割，均会将质粒切成两段，则形成的DNA片段有
（4）按照图示的操作，将三角瓶中的大肠杆菌先接种到甲培养基上，然后分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。据图分析丙培养基中含人生长激素基因的菌落有
（5）将人生长激素基因导入小鼠体内来生产生长激素，应对供体雌鼠甲用促性腺激素处理一段时间后与雄鼠乙交配，然后通过手术的方法从雌鼠的
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【推荐1】p53基因是一种重要的抑癌基因。研究人员按图示流程构建双拷贝p53目的基因片段，再将其与腺病毒穿梭质粒pShuttle连接，构建重组质粒pShuttle-du-p53并对其进行酶切，将酶切产物与复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy-1一起，经电穿孔法共转染大肠杆菌，以进行同源重组，然后筛选并提取双拷贝人p53基因重组腺病毒载体（prAd5-du-p53)，用PacI对其进行酶切使其线性化，转化真核细胞HEK293并获得病毒颗粒（rAd5-du-p53)。该病毒颗粒可为各类肿瘤的治疗提供可能的新途径。回答下列问题：
(1)图示人cDNA由人体白细胞中mRNA经逆转录获得，该过程需使用____ 酶；该过程所需原料是____ 。
(2)Pcmv是一种强启动子。对Pcmv进行PCR的过程中，需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是____ ；该过程中所选择的引物序列不能太短，且两种引物间不能发生____ 。构建双拷贝p53目的基因片段时，两个p53基因分别连接Pcmv的优点有____ （答出一点即可）。
(3)实验时，使用T4DNA连接酶相较于E.coli DNA连接酶的优势是____ 。复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy—1是经过一定处理的，包括去除编码病毒复制蛋白的区段和编码对抗宿主的抗病毒防御蛋白的区段，进行上述加工的理由是____ 。
(4)PacI酶切使prAd5-du-p53线性化的过程中，片段____ 会被去除。若以肝癌细胞株为材料，以细胞生长抑制率为指标，比较双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒对癌细胞的抑制效果，简要写出实验思路：____ 。
(1)图示人cDNA由人体白细胞中mRNA经逆转录获得，该过程需使用
(2)Pcmv是一种强启动子。对Pcmv进行PCR的过程中，需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是
(3)实验时，使用T4DNA连接酶相较于E.coli DNA连接酶的优势是
(4)PacI酶切使prAd5-du-p53线性化的过程中，片段
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(0.4)
名校
【推荐2】土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，培育耐盐碱农作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。
(1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建过表达植株（AT1-OE）。以高粱cDNA为模板，利用_____ 方法获取目的基因。如图1，选取最佳限制酶_____ 处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选T-DNA成功转入的愈伤组织，使用既能杀死原核细胞，又能杀死真核细胞的潮霉素，效果优于仅能杀死原核细胞的抗生素（如卡那霉素），原因是_____ 。进一步筛选获得所需愈伤组织，经_____ 发育成完整植株。同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。_____ ，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。
(3)高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图3。_____ 。
②通过条带_____ 可以判断，AT1与PIP2有相互作用。若想进一步验证该相互作用，可用_____ 抗体与新磁珠偶联再次进行实验。
(4)细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是_____ 。
(1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建过表达植株（AT1-OE）。以高粱cDNA为模板，利用
(3)高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图3。
②通过条带
(4)细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是
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较难
(0.4)
名校
【推荐3】科研人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，探究敲除SIMAPK4基因对番茄果实抗冻性的影响。CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对基因组特定位点的靶向编辑（工作原理如图所示），其中Cas9蛋白由Cas9基因指导合成sgRNA是单链RNA．请回答下列问题：
(1)据图分析，CRISPR/Cas 9基因编辑技术可实现靶向编辑的原因是_______ 。但该技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，实验发现sgRNA的序列长短影响成功率，越短脱靶率越______ （填“高”或“低”）。
(2)Cas9蛋白在功能上属于______ 酶，切割的是DNA中的______ 键。番茄细胞中不具有Cas9蛋白和sgRNA及相关基因。在敲除SIMAPK4基因前，科研人员需要构建SIMAPK4基因编辑载体，从而合成Cas9蛋白和sgRNA．构建好的SIMAPK4基因编辑载体需要满足的条件：____ （答出两点即可）。
(3)构建好的基因编辑载体进入番茄细胞常用的方法有______ （答出一点即可）。已知SIMAPK4基因编辑载体上有潮霉素抗性基因（HPT），且野生植株不含有HPT基因。请写出通过PCR技术筛选SIMAPK4基因被敲除的番茄的实验思路：_______ 。
(1)据图分析，CRISPR/Cas 9基因编辑技术可实现靶向编辑的原因是
(2)Cas9蛋白在功能上属于
(3)构建好的基因编辑载体进入番茄细胞常用的方法有
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