【推荐1】为实现目的基因与载体结合，以便在大肠杆菌中大量表达相应的蛋白质，研究人员进行了如图所示操作。请分析回答下列问题：

（1）将_________________________同时用BamH I切割并混合，加入___________进行连接，再与大肠杆菌感受态细胞混合，最后，将混合物接种在含有________________的平板培养基上。
（2）切割后的载体用碱性磷酸酶处理，除去末端的5’磷酸，可防止载体自我连接，目的基因片段不用碱性磷酸酶处理，仍然能与用碱性磷酸酶处理过的载体连接。在5组平板培养基上接种了不同操作的大肠杆菌感受态细胞，如下表
所示。

①第1组实验目的是确认___________________________________是否符合实验要求。
②第2组平板培养基菌落数目最大，说明大肠杆菌感受态细胞能够_________________。
③第3组实验用来检验_____________________酶是否具有活性。第4组实验用来检验________________酶是否具有活性。
④实验中用碱性磷酸酶处理载体可以降低仅有载体的菌落数，增加携带_____________的菌落比例。

【推荐2】重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物如图1．图2为用定向进化策略改造纤维素酶的过程，请回答下列问题。
(1)PCR与体内DNA的复制相比，不需要_____酶的参与。
(2)根据图1所示的叠延伸PCR过程，回答下列问题。
①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物_____，大量扩增突变产物AD则应选择引物_____，重叠延伸时不需要引物的原因_____。

②若利用重叠延伸PCR技术进行定点突变时需要如下图所示的4种引物，且PCR1中的引物a位置选择的是图3中的引物1，则b，c引物分别应该选择图3中的_____。

③重叠延伸PCR通过_____ 实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是_____。
(3)图2为利用定向进化策略改造纤维素酶的操作过程，在进行③时需要先用_____处理大肠杆菌。
(4)用定向进化策略改造纤维素酶，下列说法正确的是（       ）

A．基因工程技术是定向进化策略改造纤维素的基础

B．定向进化策略获得的纤维素酶的基因序列在筛选前是已知的

C．与定点诱变相比，定向进化策略不需解析酶的结构和功能

D．定向进化策略可以使纤维素酶朝着人们需要的方向进化

【推荐3】苯丙酮尿症是由于患者PKU基因突变引起体细胞中缺少一种酶，致使体内的苯丙氨酸代谢异常转化为苯丙酮酸，从而导致患者神经系统损害。将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上来替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因kl、k2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neo^r，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。回答下列问题：

（1）上图中通过基因定点整合过程可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞_____________，胚胎干细胞可以从_____________中进行分离得到。
（2）实验中小鼠胚胎发育到囊胚期时，聚集在胚胎一端，个体较大的细胞是_____________，可将其取出并分散成单个细胞进行培养，将来可为实验提供所需的胚胎干细胞。培养过程中培养液除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指_____________，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为_____________。
（3）用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个k基因中至少会有一个与neo^r一起整合到染色体DNA上。已知含有neo^r的细胞具有G418的抗性。kl、k2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是________的胚胎干细胞，理由_________。
（4）将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠尿液中_____________，说明PKU基因成功表达。

【推荐1】鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是____。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和___________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是_________。
A．Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同
D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有___________，步骤③中需先用______处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是___________。
（4）用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数（植物受病毒侵染的严重程度）为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79。说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有__________。

【推荐2】人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：

（1）htPA基因与载体用_________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用_________技术。
（2）为获取更多的卵（母）细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其__________。采集的精子需要经过__________，才具备受精能力。
（3）将重组表达载体导入受精卵常用的方法是__________。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行__________。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的__________。
（4）若在转ht-PA基因母羊的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。

【推荐3】普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），其能在纤维细胞中特异性表达，产生的 β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法将其导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下图所示。请分析回答：

（1）①和②过程中所用的限制性核酸内切酶分别为____________、____________。
（2）过程①中纤维细胞E6启动子在质粒1上只以一种方向的相连，请解释GhMnaA2基因在质粒2上可以正向和反向两种方向相连的原因是_______________，这种操作的缺点是目的基因容易发生___________，从而影响与质粒的拼接。
（3）基因表达载体除了图示组成外，至少还有________________________。
（4）过程③中需用CaCl₂处理农杆菌，目的是________________________，从而使外源基因容易导入。
（5）过程④利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程，整合到棉花细胞染色体DNA上去的区段是重组质粒中的____________部分，在植物组织培养前需要把与农杆菌共培养后的外植体转移到含有____________的培养基上进行脱菌培养。
（6）导入棉花细胞内的反义GhMnaA2基因转录形成的mRNA能____________从而阻止____________合成，使棉纤维更长。

【推荐1】酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可生产食品和药品等。科学家将大麦细胞的LTPl基因导入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操作过程如图所示，请据图回答下列问题：

（1）该技术的最大优点是___________。
（2）从大麦细胞中可直接分离获得LTP1基因，然后采用PCR大量扩增目的基因，其原理是___________。本操作中为了将LTPI基因导入酵母菌细胞内，所用的载体是___________。
（3）要使载体与LTP1基因连接，首先应使用___________进行切割，然后用___________进行连接。
（4）切割完成后，采用___________酶将载体与LTP1基因连接，连接后得到的DNA分子称为__________。
（5）此操作中可以分别用含有青霉素、四环素的两种选择培养基进行筛选，则有C进入的酵母菌在选择培养基上的生长情况是___________。
（6）除了看啤酒泡沫丰富与否外，还可用什么方法检测LTP1基因在啤酒酵母菌中是否表达？_________。

【推荐2】科学家从豇豆的果实内发现了一种cpti基因，该基因表达出的蛋白质——胰蛋白酶抑制剂（CpTI），具有抗虫谱广、昆虫不易对其产生耐受性且对人畜无副作用等特点，使得cpti基因成为抗虫植物基因工程一个重要的候选基因。某研究团队欲将cpti基因导入到大麦体内，获得转基因植株。回答下列问题：
(1)大麦是严格自交的二倍体农作物，自然条件下大麦大多是纯合子，主要原因有：①自花传粉，可____；②连续自交，____。
(2)将酶切后的cpti基因和质粒拼接构建的基因表达载体转入大麦细胞后，进一步培养筛选共获得9株待测个体。现对筛选出的个体进行DNA水平的检测。请填写表格，完成实验：

组别	植株编号1~9	对照组1	对照组2
模板	1~2	____	普通大麦DNA
PCR体系中其他物质	缓冲液（添加Mg2+）、水、____、4种脱氧核苷酸的等量混合液、耐高温的DNA聚合酶
电泳结果	编号1、2、4、5、9植株无条带，编号3、6、7、8植株有条带	有条带	____

(3)进一步做抗虫的效果鉴定，该团队获得了三个抗虫大麦品系甲、乙、丙。将三个抗虫品系分别与普通品系大麦杂交，F₁均表现为抗虫，且F₁自交所得F₂的表型及比例为抗虫∶不抗虫=3∶1。又将上述过程获得的甲、乙、丙三个品系相互杂交，得到的结果如下：
甲×乙→F₁抗虫→F₂抗虫：不抗虫=15∶1
乙×丙→F₁抗虫→F₂抗虫：不抗虫=15∶1
丙×甲→F₁抗虫→F₂抗虫：不抗虫=99∶1
①若依次用A/a、B/b、D/d表示甲、乙、丙三个品系染色体上与抗虫性状相关的基因，由杂交实验结果推断出甲、乙、丙三个品系中抗虫性状相关基因在染色体上的位置关系是____。
②甲与丙杂交，F₂出现不抗虫植株，这最有可能与F₁减数分裂中____有关。甲、乙杂交的F₁与乙、丙杂交的F₁杂交，所得F₂的表型及比例为____。

【推荐3】下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindIII、SmaI指示线所示为三种限制酶的酶切位点。

据图回答：
（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________限制酶，同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含____________的培养基上进行。
（2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是(      )（填字母代号）
A．启动子             B．tetR            C．复制原点            D．ampR
（3）过程①可采用的操作方法是(      )（填字母代号）
A．农杆菌转化          B．大肠杆菌转化          C．显微注射          D．细胞融合
（4）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用(      )（填字母代号）技术。
A．核酸分子杂交     B． 基因序列分析     C．抗原—抗体杂交       D． PCR
（5）基因工程的四个基本操作步骤是_____________、_______________、_______________和_______________。

【推荐1】昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）是以杆状病毒（遗传物质为双链、环状闭合DNA）作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行基因组自我扩增与目的蛋白的表达。下图是利用BEVS生产人生长激素（hGH）的过程（杆状病毒基因B中kan^r为卡那霉素抗性基因；LacZ基因编码的β­半乳糖苷酶能将无色化合物X­gal转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，若LacZ基因不能正常表达的菌落呈白色）。请回答下列问题：

(1)图中的人生长激素mRNA是从人体的________细胞中获取。图中①过程的进行需要引物（一般为色氨酸的tRNA），这是由于逆转录酶不能将单个的________聚合成DNA链。逆转录酶在引物tRNA________末端以________方向合成DNA。
(2)步骤②为重组质粒P的构建，分别用BglⅡ、EcoRⅠ切hGH基因，用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切质粒P，再用________连接，若图1是BglⅡ的识别序列，则最可能是BamHⅠ的识别序列是________。

(3)步骤③需筛选含重组杆状病毒基因B的大肠杆菌，筛选用培养基必须加入________、________、________，要获得图示培养结果，需用________法进行接种，应挑选________菌落进行重组基因的扩增与提取。
(4)昆虫杆状病毒可以作为表达载体，是利用其具有________的特性而将目的基因导入受体细胞。

【推荐3】研究发现，拟南芥的ATMYB44基因与ATMYB77基因均可以参与拟南芥耐旱性的调控。为提高水稻的耐旱性，科研工作者将一个拟南芥ATMYB44基因导入野生水稻的叶肉细胞中，经组织培养后获得了一株耐旱水稻植株M。让植株M自交得到F₁，F₁中耐旱植株：不耐旱植株=3：1.回答下列问题：
(1)科研人员提取拟南芥细胞中的ATMYB44基因的mRNA后通过逆转录可获得ATMYB44基因，通过该方法获得的ATMYB44基因与拟南芥细胞中的ATMYB44基因的DNA序列_____（填“完全一致”或“不完全一致；），原因是_____。
(2)科研工作者认为拟南芥ATMYB44基因已经成功导入了水稻细胞的染色体DNA上，根据题中信息分析，作出这一判断的依据是_____。进一步研究发现该基因己经导入了水稻细胞的J号染色体上。
(3)F₁自交，收获F₁中耐旱植株上的种子进行单独种植，其中不发生性状分离的植株约占_____，F₂中耐旱植株：不耐早植株=_____。科研人员通过反复自交，从中筛选出不发生性状分离的耐旱植株记作纯合品系甲。
(4)利一研工作者采用相同的方法将一个拟南芥AT MYB77基因导入野生水稻的叶肉细胞中，获得了耐旱的纯合品系乙。为探究AT MYB77基因是否也位于水稻细胞的5号染色体上，以纯合品系甲和纯合品系乙为材料设计最简便的遗传实验来探究，写出实验思路及预期的结果和结论，不考虑染色体互换及其他变异。
实验思路：_____。
预期结果和结论：若_____，则AT MYB77基因导入了水稻细胞的5号染色体上；若_____，则AT MYB77基因未导入水稻细胞的5号染色体上。