【推荐1】I.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T₄ DNA连接酶。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中_____________酶切割后的DNA片段可以用T₄ DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是_________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能_________；质粒DNA分子上有_______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_______________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指___________。
II.新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(5)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是_________，再通过PCR技术扩增相应的_________片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(6)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的________________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(7)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明____________________。
(8)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程________________________________________________（用文字和箭头表示）。
(9)反复接种新冠疫苗能有效帮助机体免于感染新冠病毒，原因是_______。

【推荐2】人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备药物t-PA。

(1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是____________________。扩增时，需要先根据___________设计引物。在制备高质量t-PA基因模板时，可以用高温处理的方法去除蛋白质，原因是___________。
(2)研究表明，为心梗患者注射大量t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高。若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。如图表示相关的目的基因、限制酶及抗性基因。
①改良药物t-PA的生产过程，实质是对现有蛋白质进行改造的过程，它必须通过___________来实现，原因主要是___________。
②基因工程最核心的步骤是基因表达载体的构建，其目的是___________。图中，需选用限制酶___________切开质粒，才能与t-PA改良基因高效连接。
③在筛选过程中，应该选择不含___________的大肠杆菌作为受体细胞，以便在选择培养基中筛选出导入基因表达载体的大肠杆菌。简要写出筛选的思路为___________。

【推荐3】家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒作为载体，图2为含W基因的DNA片段。回答下列问题：

   

(1)常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有_____。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式________。
(2)利用PCR技术扩增W基因时，用到的DNA聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是______。扩增完成后，常采用______法来鉴定PCR的产物。为得到含W基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯化乳酸杆菌，进行划线操作要注意_______（写出2点即可）。
(3)W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为5'→3'。下表是几种限制酶的识别序列及切割位点，图1、图2标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W基因的重组质粒，应分别使用哪些限制酶对质粒和含W基因的DNA片段进行切割？质粒_______；W基因____。

   

(4)图1基因表达载体中启动子的功能是______。

【推荐1】胰岛素对治疗糖尿病有积极的作用，为了批量生产人胰岛素，科学家提出了两种通过基因工程改造大肠杆菌来生产人胰岛素的方法。方法1：根据胰岛素A、B两条肽链人工合成两种DNA片段，利用大肠杆菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素。方法2：利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入大肠杆菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。下图为过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，请回答下列问题。

(1)该项技术操作时不选用EcoRⅠ切割质粒的原因是_____。将人胰岛素基因导入大肠杆菌，需先构建由启动子、目的基因、标记基因、终止子等组成的重组质粒，其中启动子的作用是_____。以上_____（填“方法1”“方法2”或“方法1和方法2”）获取的目的基因中不含人胰岛素基因的启动子、终止子和内含子。
(2)若胰岛素基因的编码链（与模板链互补的链）首端到末端的序列为5′—ATCTACGCGCTCATCCG…（省略3n个核苷酸序列）…CGCAGCAATGAGTAGCG—3′。为使目的基因与载体正确连接，在设计引物时可添加限制酶_____的识别序列。某同学设计如下四种PCR引物，其中适合选用的一对引物是_____。
A．5′—CTCGAGGGAAAGTCGAGT—3′
B．5'—CTCGAGATCTACGCGCTC—3′
C．5′—CAATTGCGCTACTCATTG—3′
D．5'—CAATTGCCTTTCAGCTCA—3′
(3)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。大肠杆菌经_____处理后，与重组质粒混合培养一段时间，再接种到添加了_____的培养基上，筛选出_____的菌落即为工程菌种。

【推荐2】MAP30蛋白是一种能使I型核酸核糖体失活的蛋白质，存在于苦瓜果实和种子中。实验表明MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能，近年来引起人们的广泛关注。现有一科研团队欲培育高效表达该基因的马铃薯新品种。请回答下列问题：
(1)获取MAP30蛋白基因，人们可从___________中提取RNA，再进行逆转录获得。这样得到的基因和从基因组文库中获取的基因的区别主要是其不含___________。
(2)获得目的基因后可利用PCR技术对其进行扩增，所用的缓冲液中除目的基因外，还应包括___________等物质。
(3)构建基因表达载体时，人们常常分别使用两种限制酶剪切目的基因和运载体，这样做是为了避免出现___________。
(4)将基因表达载体导入马铃薯受体细胞后，可用___________技术得到转基因幼苗。检测MAP30的基因是否成功表达，可用___________技术。

【推荐3】木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源，中国科学家利用基因工程的方法构建了一株嗜热厌氧杆菌H，以花生壳、玉米芯等为原料发酵生产生物燃料乙醇，以期提高农业废弃物的整体利用价值。请回答下列问题：
(1)研究者将取样器放入温泉底部取样，将样本加入到含有____的锥形瓶中稀释，利用厌氧技术将稀释液接种到以纤维素为_____的培养基中初步获得能降解纤维素的嗜热厌氧杆菌，培养过程所用的玻璃器皿需用______（填方法）灭菌。
(2)基于嗜热厌氧杆菌的特殊代谢能力（图a），研究人员构建了双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）的过量表达载体，图b为构建表达载体时所需的关键条件。

      
①为保证双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）能通过双酶切以正确方向插入质粒，不能使用的限制酶为____。
②目的基因的获取方法有很多种，通常使用PCR技术扩增，该技术所需的基本条件有模板、原料、___（酶）和引物，引物是指____。
③将重组表达载体导入嗜热厌氧杆菌，然后置于含有___的选择培养基中进行筛选，经鉴定及扩大培养得到工程菌。
(3)将构建的工程菌进行摇瓶发酵，结果发现乙醇产量提高，副产物乙酸产量下降，结合其代谢途径，分析出现这种结果的原因____。

【推荐1】蓝色妖姬属于最名贵的玫瑰，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家通过图1从链霉菌中获取激活基因（sfp），其中①、②、③、④为引物，获取的sfp基因经限制酶PmeI、BamHI切割后能与Ti质粒形成重组质粒；通过图2在限制酶SpeISacI、BcLI、BamHI的切割下获取靛蓝合成酶基因（idgS）、并能与Ti质粒形成重组质粒；通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。（提示：基因sfp和idgS表达的方向如图）结合相关知识回答下列问题：

(1)通过图1获取目的基因（sfp）的方法是______，选用的引物是______。
(2)基因sfp和基因idgS应分别导入Ti质粒的______和______位置，并说明原因_____。
(3)通过图1获取的目的基因能被限制SacI、BeLI、BamHI识别和切割，结合图3应选用______限制酶切割，并说明选用的原因_____。
(4)通过图2和图3构建基因表达载体时应选用______限制酶切割，并说明选用的原因______。
(5)将目的基因导入受体白玫瑰细胞，待细胞再生成植株，开出的花朵却不变蓝，可能的原因是______。

【推荐2】玉米是世界上的第三大粮食作物，广泛种植于世界各地。研究表明，转基因抗虫玉米中的细菌BT基因能表达一种毒蛋白，这种毒蛋白能有效杀死玉米螟（一种农业害虫）。请回答下列问题：
（1）BT基因在基因工程中称为_________。在基因表达载体中，除了要有BT基因外，还必须有启动子、终止子和______。若将BT基因插入到Ti质粒的_________上，通过农杆菌的转化作用，就可以使其导入玉米细胞并将其插入到玉米细胞中的染色体上。
（2）PCR是利用__________ 的原理，在利用PCR技术扩增BT基因时，需要提供模板、原料、引物、______等条件，将模板DNA加热至90〜95℃ 的目的是__________。
（3）BT基因与载体结合过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。若某限制酶的识别序列和切点是，请画出目的基因被限制酶切割后所形成的黏性末端_______。DNA连接酶对所连接的两端碱基序列__________(填“有”或“没有”）专一性要求，定性地检测BT基因的“表达”产物可采用____________________的方法。
（4）为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题，科研小组考虑将抗虫基因导入到玉米根尖细胞的__________中以防止基因污染，同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个避难所种植普通玉米，目的是_______________。

【推荐3】研究人员发现，从锥形蜗牛体内提取出的毒液有望帮助人类开发出超级速效的胰岛素。他们研究表明锥形蜗牛毒蛋白(Con-Ins GI)能加速受体细胞信号转换，比人类胰岛素更加快速的发挥作用。因此制造这类“速效胰岛素”以及利用转基因技术实现批量生产成为I型糖尿病治疗的新思路。请回答下列问题：
(1)利用基因工程制造这种速效胰岛素过程中，构建基因表达的载体一般包括目的基因、启动子、____________、____________和复制原点，标记基因的作用是__________________。
(2)为了获得目的基因可以通过提取分析毒蛋白中的__________序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，再用DAA合成仪直接大量合成。基因工程中需要DNA连接酶，根据酶的来源不同分为_______________和T₄DNA连接酶两类。
(3)将人工合成的目的基因导入大肠杆菌体内，一般先用药物处理大肠杆菌使之成为__________细胞，再将重组DNA溶于________________中与该类细胞融合，在一定温度下促进细胞吸收重组DNA分子完成转化过程。
(4)经过目的基因的检测和表达，获得的Con-Ins GI毒蛋白活性未能达到期待的“速效胰岛素”的生物活性，导致这种差异的原因可能是___________________________________________。