【推荐1】修复 DNA 双链断裂的细胞通路在细胞生长、发育和癌变中具有关键作用，近年科学家在哺乳动物真核细胞内发现参与此通路的一种独特的 DNA聚合酶（Polθ）。当DNA 双链发生断裂时，某些酶会在断裂处将5'端链切割（原双链 DNA两端的5'端因连有特殊物质""而避免被切割），形成局部单链 DNA（ssDNA 悬臂）。其上某些区域的碱基可互补配对，称为微同源区。DNA 发生双链断裂后，Polθ主要承拍检测和修复 DNA 双链断裂的工作，下图表示绿色荧光蛋白基因（GFP）在受体细胞中断裂后的修复过程。GFP含有6个碱基对的微同源区段。

(1)DNA双链因____键断裂而断开，两 ssDNA 悬臂微同源区结合依赖____。
(2)在 GFP的修复过程中，Polθ的作用具体体现在____，此时微同源区的单链片段相当于该过程中的_____，科研人员发现 Polθ基因在肿瘤细胞中高表达，主要用于发挥此项作用。
(3)核糖核苷酸替换是基因组中最常见的 DNA 核苷酸损伤，即 DNA 某条链的部分脱氧核苷酸被核糖核苷酸取代。科学家将 10 个核糖核苷酸序列替换到原 GFP基因上游的非模板链，模板链进行两个碱基替换，如下图所示，将其导入受体细胞设法使其重复上述实验过程，结果仍出现了绿色荧光。
①请阐述上述过程受体细胞中仍出现绿色荧光的机制∶_______
②上述过程说明 Polθ还具有类似于____酶的作用，科研人员发现 Pol基因在正常细胞中表达，主要用于发挥此作用。

(4)结合上述信息，请利用Polθ抑制剂和单克隆抗体为研发癌症的靶点治疗提供新思路__________________________

【推荐1】海稻86是一种重要的耐盐碱水稻种质资源，为研究海稻两个NAC转录因子OsHDNAC1和OsHDNAC2是否在其应答盐胁迫的过程中发挥功能，科研人员开展相关的实验研究。
Ⅰ、材料处理：将海稻86的种子平整、均匀散布于湿润滤纸上，28℃培养2~3d，待长出根后转移至含有营养液的植物水培盒中，置于培养箱中继续生长7d，随后用较高浓度的NaCI溶液进行盐胁迫处理，并分别于0、6、15、24、60和72h取植株地上部分，经液氮速冻后保存至超低温冰箱待用。
Ⅱ、RNA提取及cDNA合成：取冷冻于-80C的叶片经液氮研磨成粉末状，加入特定试剂提取总RNA，将提取得到的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，观察RNA的质量和完整性，并利用仪器测定RNA浓度，随后将RNA反转录为cDNA，得到的产物保存至-20℃冰箱。
Ⅲ、基因克隆及克隆载体构建：设计引物PCR扩增，在凝胶成像系统中对扩增产物进行观察检测，并对目的条带进行纯化回收。将回收得到的DNA产物连接到含有真核启动子和荧光蛋白基因的亚细胞定位载体pNC-Green-SubN上，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布至平板后于37C下培养过夜，通过菌液PCR鉴定阳性克隆，测序验证正确后，提取质粒保存至-20℃冰箱。
Ⅳ、亚细胞定位：将测序正确的质粒转化至农杆菌感受态细胞中，将农杆菌菌液注射至烟草表皮细胞，随后将烟草置于26℃、14h光照/10h黑暗的条件下培养48h，利用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光在烟草细胞中的分布情况。
Ⅴ、表达量分析：为了解析OsHDNAC1、OsHDNAC2在海稻应答盐胁迫过程中的功能，利用荧光定量PCR分析OsHDNAC1和OsHDNAC2在盐胁迫下不同时间点的表达水平。
回答下列问题：
(1)获取RNA的过程需要选择植株的地上部分，而不是直接将种子冷冻破碎的原因是______。
(2)将RNA反转录为cDNA，反应体系中应添加原料______和______酶。
(3)在对总cDNA进行PCR扩增，通过____中检索出目的基因的序列，分别设计引物OsHDNAC1-F/R和 OsHDNAC2-F/R 进行 PCR扩增。在反应体系（模板 cDNA1．0μL，正向引物和反向引物各1．0μL，2×Taq Master Mix 12．5μL，ddH2O9．5μL，足量dNTP等）中扩增。通常在PCR扩增的最后一轮，延伸10min，推测其目的是_____。用该体系进行PCR的目的是______。在过程Ⅲ中对大肠杆菌菌液PCR鉴定阳性克隆，而不选择直接观察荧光产生的原因是_______。培养大肠杆菌感受态细胞TOP10的目的是________。
(4)亚细胞定位分析显示OsHDNAC1和OsHDNAC2均定位在____（细胞质/细胞核/细胞质和细胞核），表明OsHDNAC1和OsHDNAC2基因编码的蛋白符合转录因子发挥调控功能的特点。
(5)下图为利用荧光定量PCR分析OsHDNAC1和OsHDNAC2在盐胁迫下不同时间点的表达水平，上述结果表明__________。
   

【推荐2】人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2（ALDH2）是人体酒精代谢中的关键酶。研究人员利用定点诱变技术对ALDH2基因进行改造后在大肠杆菌中表达，获得具有较好溶解性的乙醛脱氢酶2。所用质粒和操作过程如下图。其中，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因，Tet^r为四环素抗性基因。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Amp^r转录的模板链属于a链的片段。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端（其中一条链）的序列为5′-ATCCATGCGGCTC…（中间核苷酸序列）…CAGTGTAGCG-3′。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：

限制酶	BamHI	PstI	XhoI	XbaI
识别序列和切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	C↓TCGAG	T↓CTAGA

(1)通过定点诱变技术可制备自然界原本___________（选填“存在”或“不存在”）的蛋白质。
(2)质粒复制的模板链是___________（选填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）链，基因Tet^r转录的模板链属于___________的片段。若用XhoI切割质粒后，形成的单链末端碱基序列为___________。
(3)过程②需要的酶是___________。过程③常采用___________处理以提高操作效果。经过程④，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有___________。
(4)为扩增目的基因，某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用（符合题意）的一对引物是___________（选填数字序号）。根据选定的引物，至少需经过___________次循环，可获得32个符合要求的目的基因。
①5′-TCTAGAATCCATGCGCTC-3′       ②5′-TCTAGACGCTACTCACTG-3′
③5′-CTGCAGATCCATGCGCTC-3′       ④5′-GGATCCCGCTACTCACTG-3′
⑤5′-GGATCCATCCATGCGCTC-3′       ⑥5′-CTCGAGCGCTACTCACTG-3′

【推荐1】动物生长激素释放抑制激素（somatostatin，ss）为14肽小分子激素，具有抑制生长激素分泌的作用。人们设想将ss制成免疫原免疫动物，以期望能产生ss抗体进而中和体内ss，促进哺乳动物生长。科研人员设计将ss基因与乙肝表面抗原（HBsAg）基因融合并用痘苗（痘病毒）系统表达，获得表面带有大量ss决定簇的杂合颗粒，将它作为一种新型的ss激素疫苗用以促进并维持动物较长的生长期。
(1)哺乳动物中ss由____________细胞分泌，维持动物体内生长激素含量的相对稳定，抑制动物的过度生长。
(2)畜牧业生产中。为促进动物的生长，研究员利用基因工程方法制备ss亚单位苗，但不能刺激机体产生特异性免疫，可能原因是___________________。
(3)为使动物体内产生针对ss的特异性抗体，研究员构建ss基因与HBsAg基因融合并用痘苗（痘病毒）系统表达，如图所示，制备“生长抑素基因工程活载体疫苗”。

   

①根据ss的氨基酸序列，利用DNA自动合成仪合成A52和A23ss基因片段，且在5'端有____________酶切位点的，以便与pUC12质粒实现定向连接，构建成pUC12-ss质粒。筛选重组质粒时，培养基中需要添加_____________和无色的X-gal，挑选___________（填“不变色”或“变蓝色”）的菌落。
②从基因文库中提取HBs基因的质粒pWR13-HBs，从中切下HBs基因片段，用_____________酶构建成带有HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss质粒。
③构建将HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表达载体pGJP-5质粒中并导入大肠杆菌，获得的pGJP-HBs/ss质粒转染痘苗病毒，构建重组痘苗病毒vv-HBs/ss。
④重组痘苗病毒vv-HBs/ss感染的非洲绿猴肾细胞（CV-1细胞），冻存的CV-1细胞需进行___________后再用含胎牛血清的营养液在37℃的CO₂培养箱中培养24h，使CV-1细胞贴壁生长至单层细胞或80%表面积；加入适量经处理的____________，37℃培养4h，加入新鲜营养液继续培养。
(4)HBsAg测定：转染物培养48h后进行离心，取____________经缓冲液处理和稀释后加入吸附有抗HBsAg抗体的试剂盒中测定，同时以____________检测作为阴性对照。ss测定：收集上述离心得到的细胞用超声波破碎，并加入一定比例的上清液处理后进行酶联免疫检测，同时以HBsAg重组痘病毒感染的细胞培养液作为阴性对照。还可对上清液进行_________________，其中Marker中需要添加_____________。割胶回收后进一步在电镜下检查，若结果与HBsAg颗粒、大小、形态相似，表明本基因工程体表达颗粒性多价抗原，具有ss和HBsAg2种抗原。
(5)将经转染后的培养物系列梯度稀释，筛选高表达HBsAg-ss的培养瓶，继续______________培养筛选出高表达细胞株进行多次传代培养，收集重组痘病毒，用以制备疫苗。
(6)为检测疫苗的免疫效价，研究人员进行了相关实验，请完善实验思路，并设计一个表格用以记录实验结果。
I.实验思路：
①将收集的重组痘苗病毒vv-HBs/ss用____________进行10^-1至10^-5的梯度稀释；
②按痘病毒疫苗的标准剂量接种于___________的健康的家兔体，对照组接种等量的生理盐水；
③观察注射部位的丘疹、水疱、化脓等出痘反应，并且每隔一定时间检测家兔体内的___________（答2点即可）以及体重增长情况，同时还要计算饲料的消耗量，进行统计分析。
Ⅱ.实验结果记录表。请设计一个实验结果记录表，用以记录检测到的家兔体内指标。______