【推荐1】α—抗胰蛋白酶是一种主要由肝细胞合成的血浆蛋白，具有维持内环境稳定的功能。科研人员利用乳腺生物反应器获得了α—抗胰蛋白酶。回答下列问题：
(1)将人正常干细胞系L—02培养在某动物细胞培养基中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。CO₂的主要作用是____________。待细胞培养至对数生长末期，用______酶消化，进行细胞计数和离心收集，提取RNA，经____________（填过程）最终获得α—抗胰蛋白酶基因。
(2)利用PCR技术扩增α—抗胰蛋白酶基因时，科研人员在两个引物的______（填“5＇端”或“3＇端”）各添加一种限制酶的酶切位点，在该端添加的理由是____________。α—抗胰蛋白酶基因两端添加不同的限制酶切割位点的目的是____________。
(3)将α—抗胰蛋白酶基因与牛乳腺中______的启动子等调控组件重组在一起，构建成基因表达载体。若将α—抗胰蛋白酶基因直接导入牛受精卵中，往往不能获得所需的转基因牛，理由是____________。
(4)将含基因表达载体的受精卵置于早期胚胎培养液中进行培养，早期胚胎进行移植前，需进行性别鉴定。性别鉴定的操作思路是__________________。
(5)转基因牛成年后需对其α—抗胰蛋白酶基因的表达产物进行检测，一般采用______法。

【推荐2】随着全球转基因作物大规模种植和全球一体化下频繁的贸易流通，转基因监管的任务将越来越重。为了还给消费者知情权和选择权，多个国家和地区对转基因产品实行标识管理制度，这些法规实施的前提就是要建立稳定、准确的转基因检测技术。PCR转基因检测技术被多国检测工作者使用，该技术通常包括核酸提取、核酸扩增、扩增产物检测3个步骤。某研究小组设计并完成了“转基因抗草甘膦大豆定性PCR检测”实验，请参与实验设计并回答相关问题（草甘膦为常用除草剂；转基因抗草甘膦大豆的外源基因构建图如图1所示）：

图1抗草甘膦外源基因结构图（CaMV35S为外源启动子、NOS为外源终止子）
(1)提取DNA：取待测大豆组织裂解破碎，进行DNA提取和纯化，得到待测大豆基因组DNA。该过程的常用的试剂有EDTA、SDS、NaCl、酒精等。在研磨液中加入NaCl的目的是________________，提取到的DNA可以用______________试剂鉴定。
(2)DNA扩增：
①在确定扩增对象后，从___________________中获得待扩增基因序列，以此为依据可设计引物。该小组拟定的引物设计如表所示，其引物设计有一个是不科学的，请指出并说明原因____________。

基因	引物序列	产物片段大小	基因来源
Lectin	F－5' GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C－3' R－5' GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG－3'	118	内源基因
CaMV35S	F－5' GGG ATT－3' R－5' AAT CCC－3'	195	外源基因
NOS	F－5' GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG －3' R－5' TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA －3'	180	外源基因
CP4－EPSPS	F－5' CTT CTG TGC TGT AGC CAC TGA TGC－3 R－5' CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC－3	320	外源基因

注：内源基因指大豆基因组内基因，外源基因指大豆基因组外基因。
②PCR扩增：在4个反应体系中分别加入________________（模板）、相应引物、________________酶、________________等，并将PCR仪的温度设定为：变性94℃ 30s、复性58℃ 30s、延伸72℃ 40s，循环30次。“延伸”的温度设定为72℃，是因为该温度下________________。在设定的PCR体系下可以特异性扩增目标DNA片段，主要是因为__________________________________具有特异性。
(3)扩增产物检测：可采用________________的方法检测。部分实验结果如图2、3所示。据图2初步判断，该大豆为________________（填“转基因”或“非转基因”）大豆。据图2、图3分析，其实验结果是________________（填“可信的”或“不可信的”）。

注:M:标准参照物，1：阳性对照（基因标准品），2：阴性对照（普通大豆），3：核酸提取空白对照，4：待鉴定样本

【推荐3】大刍草是玉米的原始祖先，具有较强的抗病抗逆特性，为玉米育种提供了原始的遗传材料。研究发现大刍草基因组中有一个D基因仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究D基因表达对卵细胞的影响，设计了实验。据图回答：
   
(1)D基因在大刍草卵细胞中不转录，从基因结构角度推测其可能的原因是卵细胞中______。
(2)要构建大刍草的CDNA文库，应从大刍草______或______中提取总RNA．由总RNA在相关酶的作用下获得D基因编码蛋白的序列。按如图所示构建重组表达载体。
(3)在过程①、②转化筛选时，过程_____中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下大刍草卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明________。
(5)在大刍草基因组中发现另一个B基因与其育性相关，为进一步研究B基因的功能，研究者将一段T-DNA插入到B基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为b，现以野生植株和突变植株作为亲本进行杂交实验，统计母本植株的结实率，结果如表所示：

杂交编号	亲本组合	结实率
a	♀BB×♂bb	0．1
b	♀bb×♂BB	0．5
c	♀BB×♂BB	0．5

①表中数据表明B基因失活后使______（雌/雄）配子育性降低。
②让杂交a的F₁给杂交b的F₁授粉，得到F_2．为验证F₂植株的基因型，研究者据B基因、T-DNA的序列设计了3种引物，如图所示：
   
随机选取F₂植株若干，提取各植株的总DNA，分别用“引物I+III”组合及“II+III”组合进行PCR，检测是否能扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR扩增）。如果引物“I+III”组及“II+III”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为______。如果_______，则相应植株的基因型为BB．

【推荐1】毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），BglⅡ、SacI、SnaBI和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。

(1)过程①需要的原料是___________，催化该过程的酶需要___________（物质）激活。
(2)过程①应在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是___________、__________，以实现目的基因定向插入质粒。
(3)过程③需用一定浓度的__________处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是____________。
(4)若用限制酶SnaBI、BglⅡ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb；用限制酶BglⅡ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb；已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是___________，获得的重组DNA的长度为___________。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是__________。

【推荐2】某研究所根据植物“偏爱”的密码子设计，通过人工合成若干DNA片段，将其拼接成为人胰岛素基因，并将该基因置于CaMV35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下，通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。并且在胰岛素一COOH端加上KDEL内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。回答下列问题：
（1）该科研所使用的人胰岛素基因是采用______________的方法获得。要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用____________技术。该技术中使用的关键酶是________________________ 。
（2）根据上述描述，转基因操作时所用的载体是_____________________，载体上的________可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。构建的基因表达载体中应含有的结构有CaMV35S启动子、终止子、复制原点、果实专一性启动子、____________________________________。
（3）如果要检测在受体细胞中是否存在目的基因可采用___________________技术。该技术中使用的基因探针也可以用来检测________________________ 。
（4）吃这种转基因番茄不能治疗人类的I型糖尿病（由体内胰岛素分泌不足引起），从人体相关生理分析原因可能是_____________________________________________。

【推荐3】“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。
（1）Cre酶是该技术的关键酶，能随机识别两个相同的loxP序列，催化如图1所示的反应。

通过Cre-loxP系统敲除基因的基本原理是：Cre酶随机识别DNA分子上两个相同的loxP序列并从特定位点切断DNA双链，切口被重新连接后，保留片段_____，从而实现目标基因的敲除。
（2）研究者设计图2所示的DNA片段，转入小鼠体内，获得仅含一个图2所示片段的转基因小鼠。

①构建基因表达载体时，需用限制酶和_____酶处理三种荧光蛋白基因、两种loxP序列，将它们与脑组织特异表达启动子M相连接。
②研究者用显微注射法将图2所示表达载体导入小鼠的_____中，得到仅含一个图2 所示片段的转基因小鼠，再经过进一步筛选，获得纯合的转基因小鼠a。
（3）图2所示序列的两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启动子N（由信号分子X开启)连接，获得纯合转基因小鼠b，将图3所示纯合小鼠a和b杂交，得到F₁。

①无信号分子X作用时，F₁脑组织和其他组织细胞的色彩分别是_____。
②有信号分子X作用时，F₁：出现“脑彩虹”，请阐述机理：_____。
（4）研究者希望具有更丰富的颜色组合，即在一个细胞内随机出现两种或两种以上颜色叠加，形成更多颜色的“脑彩虹”，请依据题目信息，写出设计思路：_____。

【推荐1】乙型脑炎和伪狂犬病是猪的两种常见传染病。下图是利用基因工程技术生产能同时预防这两种病疫苗的流程图，其中PrM为乙型脑炎的特异性抗原基因，PK、gG、gD为伪狂犬病的主要抗原基因，TK为伪狂犬病的毒性基因，pgG为启动子，BamHⅠ和EcoRⅠ为两种限制酶，其识别序列及切割位点分别是G^↓GATCC、G^↓AATTC。请回答下列问题：

（1）过程①所需的酶有 __________和_________。下列四种引物中适用于过程①的一对引物是________。
P1：5'TTGGATCCATGGAAGGCTCAATCATGTG3’
P2：5'CACAAGCTTAGATGACGTATCCAAGGAG3’
P3：5'TACGGTACCTTAGGGGTTAAGTGGG3’
P4：5’GCGAATTCTAACTGTAAGCCGGAGCG3’
（2）过程②所需的酶有___________。过程③中要用Ca²⁺处理大肠杆菌，其目的是___________。
（3）重组伪狂犬病毒中不带TK基因的优点是_______________。
（4）将获得的病毒疫苗注射到猪体内，一方面病毒中抗原基因在猪细胞中大量表达，诱导猪获得_______免疫；另一方面______________，使得病毒投苗具有用量小、作用更持久等优点。

【推荐2】如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。请回答下列相关问题。

（1）获取“含抗虫基因的DNA”有几条途径，其中一条途径是以_____________为模板，合成互补的单链DNA，然后再合成双链DNA；另一条途径是从基因文库中获取，基因文库又可分为________文库和部分基因文库（如：cDNA文库）。
（2）基因工程的核心步骤是_________，该过程涉及的工具有______________。
（3）图中将目的基因导入受体细胞的方法是____________。图中的Ti质粒中含有_________，可将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。
（4）可运用__________技术来检测目的基因是否翻译成蛋白质。

【推荐3】浮萍是简单的单子叶水生漂浮植物，被广泛应用于除草剂的筛选、水环境污染的修复；浮萍的淀粉和蛋白含量高而被开发为生物质能和优质蛋白生产的优势原料。本研究拟通过在浮萍中表达大豆液泡膜抗盐基因来增强浮萍的抗盐性，以期获得能够应用于盐碱水域生长，并净化污水的浮萍株系。
（1）在浮萍的生长繁殖过程中，除自身分泌的激素调节外，还可以通过添加______________，以提高淀粉和蛋白质的含量。
（2）通过分析农杆菌转GUS基因的效率，筛选能进行高效的转化的菌种。GUS组织化学染色是将外植体浸没于GUS染液中染色。GUS瞬时表达率=（有相应级别GUS基因瞬时表达的外植体数/外植体总数）╳100%。使用不同农杆菌对抗性浮萍愈伤组织的GUS瞬时表达率检测结果如下图，通过检测结果显示________________________________，因此浮萍遗传转化确定选用农杆菌EHA105。

（3）本实验使用添加不同浓度乙酰丁香酮的菌液侵染浮萍，据下图实验结果发现随着____________，侵染效率_________________。乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时，浮萍的侵染效率比乙酰丁香酮浓度为200μmol/L时高出了_____%。

（4）在农杆菌介导的遗传转化过程中，防止农杆菌过度生长是转基因成败的重要环节。植物材料和农杆菌共培养结束后，转化组织需要脱菌培养，需要用抑菌类抗生素抑制农杆菌的生长，以防止农杆菌过度生长对转化组织产生毒害作用。因此选择合适的抑菌抗生素和浓度很关键。OD₆₀₀指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，通常用于细菌细胞密度(OD₆₀₀)测量。由下图可知，____________________对农杆菌EHA105都有很好的抑制效果；其最佳浓度都选用300mg/L的原因是______________________。

（5）浮萍已被成功用于植物生物反应器方面的开发和生产。植物生物反应器是指利用植物__________________或整株植株，大量生产具有重要功能的蛋白质，如抗体、疫苗或次生代谢产物等。与动物细胞和微生物发酵相比，具有明显的优势，如植物细胞具有______，能够脱分化和再分化。

【推荐1】Cre/loxP酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。
(1)图1是利用Cre/loxP酶系统敲除基因的过程。loxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区。两个loxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是___________，敲除的基因片段会形成___________（填“线状”或“环状”）结构。
       
(2)图2是利用Cre/loxP酶系统构建融合基因的过程。首先要用PCR对Bt基因和Bar基因分别扩增，以获得所需要的DNA片段，然后对连接后的DNA片段用Cre/loxP酶系统处理获得Bt-Bar融合基因片段。在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在____________；又有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5'末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5’端序列的要求是___________。

(3)图3是用Cre/loxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程。已知图中的启动子和终止子可在烟草细胞中正常发挥作用，Cre酶基因在环境中存在Tam化学物质时才能激活表达。重组Ti质粒中的Bar基因作为基因表达载体中的___________可对转化后的烟草细胞进行筛选。进行图3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正确表达，据图分析，原因是___________；若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，请利用Cre/loxP酶系统提出解决方案___________。

(4)图4是经过修饰后的转基因烟草细胞内的融合基因所在片段及相关引物的结合位点。为检测Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行鉴定：
实验组：首先提取在有Tam环境下培养的转基因烟草细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入引物1和引物2进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无Bt基因和Bar基因的条带。
对照组：用未进行敲除处理的转基因烟草细胞，其余同实验组。

若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为___________。
(5)筛选出酶后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于蛋白质工程，蛋白质工程是指_________________________________。

【推荐2】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：

（1）基因工程的核心步骤是______________。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是__末端。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T﹣A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有__种不同DNA片段．
（4）在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加__的培养基进行培养．
（5）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是__识别与结合的位点，促进转录的开始．

【推荐3】苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。图1是转Bt毒素蛋白基因植物的重组DNA形成过程示意图；图2是毒素蛋白基因进入植物细胞后发生的两种生物大分子合成的过程，据图回答下列问题。

（1）将图1①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有_____种DNA片段。过程②需要用到DNA连接酶，与T₄ DNA连接酶相比，E.coli DNA连接酶在作用上的不同是________________
（2）图1中形成重组质粒时可用HindⅢ和BamH Ⅰ进行切割后连接，与用一种酶（BamH Ⅰ）酶切后连接相比，这样做的好处是______________________________。（列出2点）
（3）图2中链是______。不同组织细胞的相同DNA进行过程③时启用的起始点______（“都相同”、“都不同”、“不完全相同”），其原因是__________________。
（4）要想检测Bt毒蛋白基因是否翻译成蛋白质，在分子水平上可用______法进行检测。