【推荐1】稻田生物固氮作用是稻田氮素循环的关键环节，某些蓝细菌是自生固氮菌（独立生活时能够利用空气中游离的氮分子作为氮源，并将氮分子转化为氨，氨转化为铵盐后是植物良好的氮素营养）。蓝细菌中B基因（长度为0.9kb）表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO₃的载体蛋白，科学家利用基因工程等技术，尝试将蓝细菌的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收NO₅能力较强的转基因水稻，从而增加粮食产量。下图1是农杆菌的Ti质粒结构图（Tet、Amp'分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因），图2为蓝细菌B基因的结构模式图。回答下列有关问题：

限制酶	BamH I	Bcl I	Sma I	Sau3A I
酶切位点	5’-G↓GATCC-3’	5’-T↓GATCG-3’	5’-CCC↓GGG-3’	5’-↓GATC-3’

(1)目的基因的获取：利用从细菌中提取的DNA通过PCR技术获取B基因时，除了需要向反应体系中加入DNA模板，缓冲液（含Mg²⁺），还需要加入_______（至少写两种）等。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的5’端分别引入_______两种不同限制酶的识别序列。
(2)基因表达载体的构建：①用（1）中选取的限制酶同时对目的基因和载体进行酶切，得到酶切产物后，再选用_________（填“E.coli DNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）将目的基因和载体进行连接，得到重组载体，随后进行转化操作。②为筛选获得目的菌株，将转化后的大肠杆菌接种在含______的固体培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图，______号菌落的质粒很可能是含B基因的重组质粒，并进行测序验证。

注：M为指示分子大小的标准参照物：小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(3)将重组的Ti质粒转入农杆菌，利用农杆菌的转化作用将目的基因导入水稻细胞。目的基因的检测与鉴定：为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可通过PCR、抗原-抗体杂交等技术在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路________。

【推荐2】DNA测序是生命科学常规技术，可用于人类基因组和其他许多动物、植物和微生物物种的完整DNA序列的测定。链终止DNA测序法主要步骤是:先向DNA复制体系中加入能够终止新链延伸的某种脱氧核苷酸类似物，以得到各种不同长度的脱氧核苷酸链；再通过电泳呈带(按分子量大小排列)，从而读出对应碱基的位置(如图)。请分析回答:

(1)图中“加热变性”的过程实质是使_________断裂，人体细胞中完成该过程必须有__________的催化。
(2)DNA聚合酶的作用是___________。
(3)若用上述测序方法读出新链中碱基T的位置，则必须加入带标记的______类似物。
(4)采用上述链终止法测定人类基因组DNA中的全部碱基排序，你认为至少要按图中所示模式操作_______次。

【推荐3】PCR技术可用于扩增目的基因、引入定点突变等。大引物PCR定点诱变技术的操作过程如图所示。回答下列问题：

(1)PCR过程中，温度的控制至关重要。若变性温度过低，则会因___导致反应效率降低；若退火温度过高，则会因___导致目标产物的量减少。利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入引物的原因是___。一般还要向PCR反应缓冲溶液中添加Mg²⁺，目的是___。
(2)进行大引物PCR定点诱变时，需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2）。在PCR1中，至少需要经过___个循环才能获得图中所示大引物。在PCR2中，若要获得带有突变位点的改良基因，则应选择的引物是___（填“①”或“②”）。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶中DNA分子的迁移速率与___（答1点）有关。若在某次利用PCR扩增目的基因后，发现有除目的基因外的其他DNA片段存在，可能的原因是___（答2点）。

【推荐1】为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。
(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用____________法从陆地棉基因文库中获取酶D基因。从拟南芥基因文库中获取转运肽基因。所含三种限制酶（Cla I、Sac I、Xba I）的切点如下图所示。则用______________和_____________酶处理两个基因后，可得到____________ （填图中字母）端相连的融合基因。

(2)将上述融合基因插入右上图所示质粒的T-DNA中。构建____________并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含____________的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用培养基振荡培养，可以得到用于转化的浸染液。
(3)剪取油菜的叶片放入染液中一段时间后筛选获得转获因油菜细胞。该细胞通过____________技术。可培育成转基因油菜植株。
(4)提取上述转基因油菜的mRNA.在逆转录酶的作用下获得cDNA.再依据______的DNA片段设计引物进行扩增。对扩增结果进行检测。可判断融合基因是否完成_______________。
(5)用_______________法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。

【推荐2】2020年新型冠状病毒（单股RNA病毒）引发了世界性的疫情。各国都加紧了关于新型冠状病毒肺炎预防和治疗的研究。请回答下列问题：
（1）新型冠状病毒肺炎爆发后，我国科学家很快进行了新型冠状病毒的基因测序，发现了新型冠状病毒的保护性抗原基因，它是较小的一段核苷酸序列，这为进行基因疫苗的研究奠定了基础。基因疫苗制备的重要步骤是构建基因表达载体，其目的是__________。其中目的基因就是保护性抗原基因，该基因获得的途径推测为__________。基因表达载体除目的基因外，还应该有__________等构件。
（2）新型冠状病毒肺炎的治疗中，有研究者提出了“用新冠肺炎康复者血浆治疗危重患者”的建议，并获得国家科技部紧急立项。这是因为康复者的血浆中含有__________，与它产生有关的细胞有__________（至少写三种）等。
（3）利用新型冠状病毒的单克隆抗体是治疗新冠肺炎的重要手段。下图是单克隆抗体制备过程示意图，其中常用的促融剂是__________，HAT培养基培养的目的是__________，克隆化培养抗体筛选的目的是__________。

【推荐3】ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术（原理见图1），可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点，图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义表达载体的结构示意图。请回答：

(1)图2中的2A11为启动子，启动子是指_________。
(2)从番茄成熟果实中提取RNA为模板，利用_________酶合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，再进行拼接构成融合基因。
(3)合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端分别是XbaⅠ和SacⅠ的酶切位点，用限制酶XbaⅠ对上述两个基因进行酶切，使_________键断开，再利用_________将其串联成融合基因，相应的Ti质粒应用限制酶_________进行切割，确保融合基因能够正确插入载体中。
(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因_________（填“正向”或“反向”）插入在启动子2A11的下游即可构成反义融合基因。将表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有_________的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，经克隆化培养后，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。

【推荐1】应用生物工程技术可以获得人们需要的生物新品种或新产品，如下图所示：

Ⅰ．“滔滔”是我国第一例转入人体白蛋白基因的转基因试管牛, 人们利用该转基因奶牛的乳汁能生产人类血清白蛋白．请利用已有知识，回答下列与该试管牛有关的问题：
(1)在培育转入白蛋白基因牛过程中，①过程常用的方法是________________。
(2)将人体白蛋白基因导入受精卵中，当受精卵分裂到____________时，需要取滋养层细胞进行鉴定___________，以确保发育成熟的牛能分泌乳汁。同时还要用基因探针与目的基因杂交，以检测_________________________。
(3)②过程中，可以采用________________技术，培育出多头相同的转基因犊牛。
(4)“滔滔” 发育成熟后，分泌的乳汁中含有人体白蛋白。目的基因的表达过程可表示为：_____________________________________________。
(5)试管牛的培育除可利用上述方法外，科学家利用___________激素，使优质母牛能超数排卵，而后再从卵巢中采集卵子培养。采集优质公牛的成熟精子，需先培养在含肝素等物质的溶液中，目的是使精子________。处理后的精子和培养成熟的卵子在培养液中完成受精。
Ⅱ．回答下列与抗虫棉有关的问题：
(6)在抗虫棉培育过程中，③过程中的受体细胞如果采用愈伤组织细胞，与采用叶肉细胞相比较，其优点是_________________。
(7)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有_____________________。

【推荐2】蓝藻B基因表达的B蛋白是一种高效吸收NO₃^-的载体蛋白，科学家利用基因工程和细胞工程等技术，尝试将蓝藻的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收NO₃^-能力较强的转基因水稻，增加粮食产量。如图1、2分别是农杆菌的Ti质粒和蓝藻B基因的结构模式图。回答下列问题：

(1)利用PCR技术以图2中的DNA片段为模板扩增B基因时，需要的引物有______，判断理由是______。B基因的一条单链在PCR仪中进行n次循环，需要消耗_________个引物。
(2)构建含B基因的表达载体时，需要用限制酶_____切割Ti质粒和B基因，不选用其他限制酶的原因是_____。
(3)将目的基因导入水稻细胞可采用_______法，一般不采用农杆菌转化法，原因是______。
(4)为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可采用抗原—抗体分子杂交法在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路：_______。

【推荐3】多酚氧化酶（PPO）基因的大量表达是促使果实褐变的主要原因之一。科研人员将获得的PPO基因反向插入质粒中，构建PPO基因的反义表达载体（重组质粒），并在农杆菌介导下实现了对鸭梨组培苗的转化，其操作流程如图所示。回答下列问题：

   

(1)可利用PCR技术获取目的基因，依据的原理是__________，该过程需要根据__________设计特异性引物序列，过程①是__________。
(2)应选择__________两种限制酶对质粒进行切割，使用两种限制酶切割的优点是___________________。
(3)PPO基因的反义表达载体导入到受体细胞后，表达出的mRNA与受体细胞中的多酚氧化酶（PPO）基因的mRNA能够进行__________，从而__________（填“抑制”或“促进”）PPS基因的表达。
(4)过程③表示__________，若想要诱导愈伤组织生根，需要的激素条件是_________。