【推荐1】研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊,以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取）,过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成来影响亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种氨基酸）,基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题:

限制酶	识别序列和切割位点
BamHI	-G↓GATCC-
BglII	-A↓GATCT-
HindⅢ	-A↓AGCTT-
XbaI	-T↓CTAGA-

(1)过程①通过PCR技术扩增物质A,需要的酶是_______;过程②需要的限制酶有_______;过程③需要的酶是限制酶和_______。
(2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞,质粒S中用作标记基因的是_______和_______。为达到筛选目的,培养基的营养成分中应不含有_______。将成纤维细胞培养一段时间后观察,筛选出_______（填“显示”或“不显示”）绿色荧光的细胞用于过程⑤。
(3)过程④常用_______法,过程⑨为_______。图中早期胚胎的_______（填结构）将发育成转基因羊的各种组织。

【推荐1】P5CS是植物合成脯氨酸的关键酶，脯氨酸有助于植物抵御干旱。下图是将P5CS基因转入烟草细胞获得耐旱烟草植株过程的示意图。

请回答：
(1)要将P5CS基因成功插入Ti质粒中，Ti质粒的_________中应含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位点。③过程需在农杆菌的培养基中添加________________才能筛选出含P5CS基因的Ti质粒的农杆菌。
(2)检测P5CS基因是否整合到烟草细胞染色体DNA上，采用________技术，转基因是否成功可以直接在个体水平上对转基因植物与非转基因植物的____________性进行比较。
(3)将转入P5CS基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用________________技术，愈伤组织通过____发育成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加_________________。

【推荐2】紫花苜蓿营养价值很高，具有清脾胃、利大小肠，下膀胱结石的功效。科学家将tms基因和tmr基因导入紫花苜蓿的愈伤组织，从而获得了紫花苜蓿的冠瘿组织，改造过程中购建的基因表达载体如图所示。请回答下列问题。

（1）tms基因和tmr基因通常需要通过PCR技术扩增，扩增时一般需要在引物的5′端设计一段____________酶的识别序列，以便构建重组DNA分子，并需要在反应体系中加入__________种引物。图中Ti质粒上的T-DNA是指__________________。
（2）基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，图中p的作用是___________________ 。为了鉴别受体细胞是否转化成功，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的是__________。
（3）与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是______________________。如果利用农杆菌转化单子叶植物的受体细胞，为了吸引农杆菌移向单子叶植物的受体细胞，需添加________物质。

【推荐3】人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：

请回答下列问题：
（1）为了获取更多的卵（母）细胞，通常给供体母羊注射_____激素进行超数排卵处理。采集的精子需要经过____处理，才具备受精能力。
（2）为了使htPA基因顺利在羊的乳腺细胞中表达，要将htPA基因与____等调控组件重组在一起，通过______方法导入羊的受精卵，然后将受精卵通过一系列技术手段培养成转htPA基因母羊。
（3）受精卵经过卵裂可以发育成早期胚胎，卵裂实际上是细胞的____分裂。在胚胎发育的_____阶段前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎潜能。
（4）代孕母羊对植入子宫的早期胚胎基本上不发生_____，这就为早期胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。在胚胎移植过程中，若要对胚胎性别进行鉴定，应取囊胚的______细胞做DNA分析。

【推荐1】慢性病人常出现白蛋白值偏低的状况（ 比如慢性肝病、慢性肾病、肿瘤等），缺乏白蛋白人就容易出现浮肿。人体的白蛋白正常值在每100ml血液中含有3.8～4.8克，如果比正常值低很多时就需要注射人血白蛋白，所以临床上对白蛋白需求量很大。下图是利用崂山奶山羊乳腺生物反应器制备药用白蛋白的流程图：

(1)要实现①超数排卵，应在崂山奶山羊A发情周期的某一阶段用_____处理，然后在恰当时期采集卵子。通过②采集的精子不能直接使成熟的卵子受精，要对精子进行获能处理，对羊的精子常用化学诱导法，即用一定浓度的_____诱导精子获能。
(2)若我们已知白蛋白基因的碱基序列，一般采用_____获取目的基因。要使人的白蛋白基因在奶山羊乳腺细胞中特异性表达，完整的基因表达载体要包括目的基因、_____、_____、标记基因等部分。
(3)过程④需将重组质粒用_____方法注入受精卵的雄原核内，在显微镜下判断是否完成受精作用的标志是_____。
(4)对移植前的胚胎进行性别鉴定时，宜取囊胚期的_____细胞进行鉴定，一般采用SRY-PCR方法，选择出现阴性反应的_____（性别）胚胎进行移植。
(5)为了使胚胎移植能成功，需要对代孕奶山羊C进行_____处理，使之与供体的生理状况保持相同。

【推荐2】日本下村修、美国沙尔菲和美籍华人钱永健因在研究绿色荧光蛋白(GFP)等方面的突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。下图为我国首例绿色荧光蛋白(GFP)转基因克隆猪的培育过程示意图，据图回答：

(1)绿色荧光蛋白基因在该实验中是作为________基因。图中通过过程①、②形成重组质粒，需要限制酶切取目的基因和质粒。限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性末端：______________。
(2)过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多也最有效的方法是______________________________________________________________。
(3)如果将切取的GFP基因与抑制小猪抗原表达的基因一起构建到载体上，GFP基因可以作为基因表达载体上的标记基因，其作用是_________________________________________。
(4)目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是(用数字表示)________________。
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列
③蓝色荧光蛋白基因的修饰(合成)
④表达出蓝色荧光蛋白

【推荐3】某质粒上有SalI、HindⅢ、BamHI三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图甲所示，请回答下列问题：
   
(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状（变异性状）的来源属于___________。
(2)在构建重组质粒时，应选用图中___________两种酶对质粒含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
(3)将重组质粒导入农杆菌前，需要先用Ca²⁺处理农杆菌，目的是___________。
(4)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，上图乙表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入了农杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有___________、___________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是___________（填数字）菌落中的细菌。

【推荐1】下图是某实验室构建基因表达载体的过程示意图，质粒A0具有四环素抗性基因(tet^r)和氨苄青霉素抗性基因(amp^r)。据图回答问题：

(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体A1为______末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体A1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成A2；A2和目的基因片段在________酶作用下，形成基因表达载体A3。
(3)为筛选出含有基因表达载体A3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________、______________。

平板类型 菌落类型	无抗生素	四环素	氨苄青霉素	氨苄青霉素＋四环素
A	＋	＋	＋	＋
B	＋	－	＋	－
C	＋	－	－	－

注：“＋”代表生长，“－”代表不生长

【推荐2】结球甘蓝是我国重要的蔬菜品种，危害甘蓝生长的主要是菜青虫等鳞翅目害虫。为使结球甘蓝获得抗虫性状，科研人员将苏云金芽孢杆菌中的BT毒蛋白基因导入结球甘蓝。回答下列问题：
(1)转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入叶绿体。为构建BT 毒蛋白基因和转运肽基因的融合基因（见图1），需用限制酶______处理相关的DNA片段，再用______连接。

图1

注： El、 E2、 E3、E4为限制酶。
(2)构建基因表达载体时，应将融合基因插入Ti质粒的______区。用Ca²⁺处理农杆菌后，使细胞处于一种______的生理状态，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加______的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。

（注：GUS基因表达产物经染色能由无色变成蓝色）
(3)鉴定愈伤组织中是否含有目的基因，可以用分子水平检测中的______等技术，还可以通过肉眼观察选择______的愈伤组织，以确定目的基因是否______。
(4)为获得具有抗性的转基因结球甘蓝，还需要进行个体生物学水平的签定。请设计实验方案_____________。

【推荐3】科学家应用抗旱基因培育出了耐旱玉米新品系，为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐旱基因（mt1D）编码链首端到末端（其中一条链）的序列为5′-ATCTACGCGCTCATCCG…（省略3n个核苷酸序列）…CGCAGCAATGAGTAGCG-3′。下图1为构建重组质粒的过程示意图，BamH I、Bcl I、Sma I、Sau3A I为限制酶（四种酶的识别序列详见表），箭头表示转录方向。回答下列问题：

限制酶	BamH I	Bcl I	Sma I	Sau3A I
识别序列及切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	T↓GATCA	CCC↓GGG	↓GATC

          
(1)为获取更多mt1D基因，可采用PCR技术扩增，在反应体系中除加入引物、dNTP、缓冲液、Mg²⁺外，还需要加入______。某同学设计了如下六种PCR引物，其中适合选用的一对引物是______（选填序号）。
①5′—GACTACTCGCGCATCTA-3′②5′—ATCTACGCGCTCATCCG-3′③5′—GCGATGAGTAACGACGC-3′④5′—CGCTACTCATTGCTGCG-3′⑤5′—TAGATGCGCGAGTAGGC-3′⑥5′—CGCAGCAATGAGTAGCG-3′
(2)若PCR反应得到的非特异性扩增产物偏多，从引物设计和温度控制角度考虑，主要原因可能是______。
(3)为将图中质粒A和mt1D基因正确连接构建重组质粒B，设计mt1D基因的引物时，在两种引物的5′端分别添加______限制酶的识别序列，选用______限制酶切割质粒A，酶切后的载体和目的基因片段通过______酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，应首先在筛选平板培养基添加______，再将平板上长出的菌落通过影印平板法接种到添加______的平板培养基上继续培养观察。
(4)若从平板上长出的菌落中提取重组质粒B利用Sau3A I进行完全酶切，最多可以得到______种大小不同的DNA片段。
(5)图2是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接，则图中M连接处的序列正确的是______（填序列编号）。