【推荐2】重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图所示。回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链﹐还需要加入________。
(2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是______。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是_______。②过程不需要加入引物，原因是________。
(3)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图所示。则融合基因最可能是________，判断依据是________。

【推荐3】双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）常用于DNA测序。图1是脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸的结构示意图，图2表示的是同一模板在复制时加入不同双脱氧核苷酸后得到的不同互补链。在DNA复制过程中，子链延伸时，ddNTP一旦连接到子链末端，子链就会停止延伸。回答下列问题：

(1)据图1分析，ddNTP包含具体类型有ddATP、ddTTP、ddGTP、__________等4种；据图2分析，图示DNA模板复制延伸时需要__________酶催化。
(2)DNA分子正常复制时，在其子链延伸过程中，脱氧核苷酸相连会形成3’，5’-磷酸二酯键，以此键连接形成DNA分子骨架。结合上图分析，当游离的dNTP或ddNTP与子链连接时，它是与子链上脱氧核苷酸的__________（填“1′”、“2′”或“3′”或“”）端的相关基团相连接的。当ddNTP一旦连接到子链末端时，子链就会停止延伸，据图推测其原因是_________。
(3)图2“？”处除了■—GATTCGAGCddT外还有_________。
(4)细胞外进行DNA复制时，常用dNTP作为原料，不需要ATP供能，其原因是_________。

【推荐1】随着社会的发展，器官移植日渐普遍。大多数移植器官都来自意外事故中失去生命的人， 由于每年适合移植的器官太少，科学家开始寻找新的“人体配件”，比如说从动物身上获取。当患者获得他人或动物器官时，其免疫系统会很快发现有异物进入身体，而现在还没有特效药来阻止免疫排斥反应的发生，还没有任何药物能让人体把猪心当作自身心脏对待。
（1）研究工作在继续，借助基因技术，科学家已改变了猪的几种遗传物质，使它们的心脏和人类心脏更加接近。α-1，3 半乳糖苷转移酶是猪细胞表面存在而人体内没有的抗原，利用基因打靶技术对猪细胞α-1，3 半乳糖苷转移酶基因进行改造，去除α-1，3 半乳糖苷转移酶引起的免疫排斥反应，主要过程如图。
①构建打靶载体需要___________________（填酶的名称）。打靶载体构建后，“靶基因”即α-1，3 半乳糖苷转移酶基因_____________________（填“能”或“不能”）表达，原因是_________________。
②利用克隆技术，使突变 ES 细胞增殖、分化，培育出不能合成α-1，3 半乳糖苷转移酶的猪器官， 但还不能将此器官直接移植入人体，原因是__________________________。
（2）利用人体细胞克隆组织或器官，其和自身的组织或器官具有相同的____________， 这样不仅可以消除人体器官移植中的排异反应，而且可以解决可供移植的人体器官严重缺乏的难题。比如说，用心脏病患者的一个细胞克隆出一个新的心脏，然后移植到患者体内，患者不需要通过药物来避免排异反应，因为克隆出的心脏所用的原材料就来自他本人。
（3）我国“全面二孩”政策给一些高龄夫妇带来了福音，他们借助试管婴儿技术实现了自己的“二孩” 愿望。试管婴儿技术__________（填“属于”或“不属于”）克隆技术，其技术手段有_____________、早期胚胎培养和胚胎移植。胚胎培养液中除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两素”（维生素、激素）、“两酸”等营养成分，以及血清等物质，其中“两酸”是指____________。

【推荐2】普通棉花中含有β-甘露糖甘酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖甘酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如图，请分析回答：

（1）①和②过程中所用的限制性核酸内切酶分别是____________和____________。
（2）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶完全切割正义基因表达载体获得0．05kb、3．25 kb、5．95 kb、9．45 kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是_________和__________。
（3）④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是_____________，转化后的细胞再通过______________形成植物体。
（4）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制______________过程，使棉花纤维_________（更长、不变、更短）。

【推荐3】如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，使大肠杆菌的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。EcoRI、PvuI为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请回答：

   

(1)利用PCR技术对一个目的基因扩增n次，需要____________对引物，热稳定DNA聚合酶能从引物的____________端开始连接脱氧核苷酸，从而获得大量目的基因D。
(2)据图分析，质粒A、C不能作为目的基因D的载体，理由分别是________________________。将目的基因D与质粒B进行重组，应该选用的酶有____________。
(3)在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因D是否重组到质粒中，使用EcoRI处理重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.6kb和3.1kb，或者____________kb和____________kb的片段，则可判断质粒B已与目的基因D重组成功。
(4)利用自身不含lacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中，筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是：在含有________________________的培养基上培养，形成____________色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。
(5)下列关于基因工程常用运载体——质粒的说法正确的是____________。

A．使用质粒作为运载体可避免目的基因被分解

B．质粒只有与目的基因重组后才能进入细胞

C．质粒上具有1个至多个限制酶切点，以便于切割后与目的基因连接

D．质粒的复制和表达也遵循中心法则

【推荐1】大肠杆菌的质粒上含有LacZ基因，其编码的产物β半乳糖苷酶在x-gal和IPTG同时存在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。下图为利用该质粒进行的转基因过程，回答下列问题：

(1)在基因工程中，大肠杆菌质粒通常作为___________,除此以外，基因工程操作还需要___________和___________两种工具。
(2)基因工程的核心操作步骤是______________________。
(3)本题中将目的基因导入受体细胞的方法是___________，目的基因在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为___________。
(4)加入了X-gal和IPTG培养基被称为___________培养基，能够筛选出含目的基因的菌落是___________(填“①”“②”或“③”)，颜色是___________。

【推荐2】 IKK 激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷（SCID）患儿IKKβ基因编码区第1183位碱基T突变为C， 导致IKKβ上第395 位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出 SCID 模型小鼠，主要过程如下图1、2。

(1)在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKβ基因外，主要还需要加入______________等。可以通过_______________来初步鉴定PCR产物，还可将含有_____________的凝胶切割下来回收凝胶中的DNA，进一步通过 DNA 测序技术鉴定PCR产物。
(2)在图 1 获取突变基因过程中，需要以下 3 种引物：
引物A： 5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'（下划线字母为突变碱基）
引物 B：5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶 HindIII识别序列）
引物C： 5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'(下划线部分为限制酶SacI识别序列）
上述三种引物中，在PCR1中使用的引物有_____________、_____________，在PCR2中使用的引物有_____________，PCR2中另外一种引物是图中大引物的_____________（填“①”或“②”）链。
(3)图2模型鼠培育过程中杂合模型鼠（F₀）的培育涉及了一系列现代生物技术，下表是其中的一些步骤，请根据题意完成表格内容。

过程	实验目的	步骤要点
导入	a．处理突变基因与载体	①利用限制酶________（填“HindIII”、“SacI”、“HindIII和SacI”）处理突变基因和载体
	b．构建重组载体	利用DNA连接酶催化突变基因和载体连接
	c．导入目的基因	②通常利用________法将重组DNA导入小鼠受精卵
发育	d．胚胎体外培养	利用专用培养液培养受精卵，并检测其发育状况
	e．代孕获得小鼠	③选择体外培养至________，植入代孕母鼠子宫角，直至小鼠出生
	f．鉴定、筛选F0小鼠	利用PCR鉴定基因，筛选出杂合鼠F0

(4)图2所示的F₀小鼠若要在胚胎时期就确定其性别，则可取_____________细胞，进行_____________分析来判定。根据图2杂交结果，可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的染色体上，在遗传时遵循_____________定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制：_____________。

【推荐3】I．新一代基因编辑工具由 Cas9（一种限制性核酸内切酶）和向导RNA构成。该复合体能与DNA分子上的特定序列结合，并在合适位点切断DNA双链（如下图所示）。DNA被切断后，细胞会启动DNA损伤修复机制，在此基础上如果为细胞提供一个修复模板，细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，从而实现基因编辑。请回答：

（1）在将编码Cas9的基因导入真核细胞的转基因操作中，若控制合成Cas9的基因序列已知，可用_______方法合成目的基因，再构建表达载体导入真核细胞。上述转基因操作成功的标志________________。
（2）如图1所示，基因编辑工具发挥作用时，向导RNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列因为碱基互补序列所以能结合在一起，然后由Cas9催化__________键断裂，从而使 DNA分子断裂。
（3）一般来说，在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和_____（填“相同”或“不同”）的向导RNA进行基因的相关编辑。
（4）如图2所示，若用两种识别切割序列完全不同的限制酶E和F从基因组DNA上切下目的基因，并将之取代质粒pZHZ1(3.7kb，1kb=1000对碱基)上相应的E—F区域(0.2kb)。已知在质粒pZHZl中，限制酶G切割位点距限制酶E切割位点0．8kb，限制酶H切割位点距限制酶F切割位点O．5kb。若分别用限制酶G和H酶切两份重组质粒pZHZ2样品，据表所列为酶切结果。请将目的基因内部的限制酶G和H切割位点标注在图3中。_______
Ⅱ．青光眼是导致人类失明的三大致盲眼病之一，其中发育性青光眼（婴幼儿型和青少年型）具有明显的家族遗传倾向。检查发现，发育型青光眼患者角膜小梁细胞中M蛋白异常。为研究其病因，研究者用含绿色荧光蛋白基因G或红色荧光蛋白基因R的质粒、正常人M蛋白基因（M⁺）或青光眼患者M蛋白基因（M^-），构建基因表达载体，分别导入Hela细胞中进行培养，一段时间后检测培养液和细胞中荧光的分布情况，实验分组及检测结果如下表（示只含荧光蛋白基因的质粒片段；示含荧光蛋白基因和M蛋白基因的质粒片段，此时两基因表达的产物是一个整体）。
（1） 据下表推测，发育型青光眼的病因是_______异常导致其指导合成的M蛋白异常，导致小梁细胞中的M蛋白___________________，而在细胞中大量积累，最终导致小梁细胞功能异常。
（2）下表中第___________组实验可以判断：发育型青光眼是显性遗传病。

【推荐2】1897年德国科学家毕希纳发现，利用无细胞的酵母汁可以进行乙醇发酵；还有研究发现，乙醇发酵的酶发挥催化作用需要小分子和离子辅助。某研究小组为验证上述结论，利用下列材料和试剂进行了实验。
材料和试剂：酵母菌、酵母汁、A溶液（含有酵母汁中的各类生物大分子）、B溶液（含有酵母汁中的各类小分子和离子）、葡萄糖溶液、无菌水。
实验共分6组，其中4组的实验处理和结果如下表。

组别	实验处理	实验结果
①	葡萄糖溶液＋无菌水	－
②	葡萄糖溶液＋酵母菌	＋
③	葡萄糖溶液＋A溶液	－
④	葡萄糖溶液＋B溶液	－

注：“＋”表示有乙醇生成，“－”表示无乙醇生成回答下列问题：
（1）除表中4组外，其它2组的实验处理分别是：_______________；__________________。本实验中，这些起辅助作用的小分子和离子存在于酵母菌、____________________
（2）若为了确定B溶液中是否含有多肽，可用___________试剂来检测。若为了研究B溶液中离子M对乙醇发酵是否是必需的，可增加一组实验，该组的处理是_____________________________
（3）制备无细胞的酵母汁，酵母菌细胞破碎处理时需加入缓冲液，缓冲液的作用是__________________________________________________________________，以确保酶的活性。

【推荐3】某同学从土壤中分离得到A和B两株可以降解秸秆的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解秸秆的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K₂HPO₄，MgSO₄，NH₄NO₃，纤维素，刚果红。
培养基Ⅱ：K₂HPO₄，MgSO₄，纤维素，刚果红。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ。
回答下列问题。

菌株	透明圈大小
	平板Ⅰ	平板Ⅱ
A	+++	++
B	++	-

(1)培养基在制备的过程中需要灭菌，最常用的灭菌方式是____________。培养基中NH₄NO₃的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成______________（答出2种即可）等生物大分子。
(2)为了比较A、B降解秸秆的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是：在无菌条件下，__________。
(3)该同学还设计了一个利用秸秆生产燃料乙醇的小型实验。实验流程如图所示。

  

①在粉碎的秸秆中接种菌T，菌T应该选择______（A/B）更适宜，其原因是_______。
②本实验收集的淋洗液中的_______可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是_____________。