【推荐1】SLA-2基因是猪白细胞抗原基因，在动物免疫应答中发挥作用。为研究SLA-2基因的结构和功能，科研人员克隆到SLA-2基因，并在构建真核表达质粒后，转染猪肾上皮细胞，进行后续研究，其主要过程如下图（SLA-2基因长度为1100bp，质粒B的总长度为4445bp，质粒中数字代表在京限制酶切点与复制原点间的距离）。请回答：

限制酶	BclⅠ	NotⅠ	XhaⅠ	Sau3AⅠ
识别序列及切割位点	T↓GATCA ACTAG↑T	GC↓GGCCGC CGCCGG↑CG	T↓CTAGA AGATC↑T	↓GATC CTAG↑

(1)从猪基因组中特异地克隆出SLA-2基因的关键是_______，依据基因片段的大小，实验室可利用_______技术初步鉴定该基因。
(2)限制酶BclI与Sau3AI切割相同DNA形成的黏性末端是否相同?_______，其中_______在该DNA上的切点可能更多。
(3)下列引物序列中，图示过程①中的引物是_______。为提出SLA-2基因的表达量，研究人员同时对基因的5'序列进行密码子优化设计（如GGT优化为GGC），优化的序列位于基因的________（编码区/编码区上游/编码区下游），这种优化实现变异属于_______。
①5'-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAATCCTC
②5'-GTTGCGGCCGCTCACACTGTGGCTTGGTAACAC
③5'-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAATCCTC
④5'-GTTTGATCACTCACACTCTAGGCCCTTGGTC
(4)过程②和过程⑤中均构建了重组质粒，其中属于真核表达质粒是在过程_______中构建的，这类表达质粒上必须有目的基因、_______等结构，其目的是_______。

【推荐2】Ⅰ.在以鸡血为实验材料的DNA进行粗提取的实验中，若需进一步提取杂质较少的DNA，可以依据的原理是( )
A.DNA不溶于酒精,而细胞中的某些蛋白质则溶于酒精
B.在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色
C.大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA能忍受
D.DNA在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小
Ⅱ.基因工程疫苗是把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。例如将乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入酵母菌基因组中，可制成DNA重组乙型肝炎疫苗。请回答下列问题：
（1）获取乙型肝炎病毒表面抗原基因的方法有多种。例如，可根据表面抗原蛋白质的结构推测________，进而推测目的基因的脱氧核苷酸序列，再进行人工合成。目的基因合成后可在Taq酶的作用下通过PCR技术大量扩增，该技术的原理是________________________，PCR扩增前要根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成____________。
（2）目的基因在导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，该过程需要的工具酶有____________。基因表达载体中应有RNA聚合酶识别和结合的部位，该部位称为____________。
（3）目的基因在受体细胞内是否翻译出蛋白质，可用____________技术来检测。若研究人员将目的基因导入酵母菌细胞后，未能稳定维持和表达其遗传特性，分析其原因可能是：________________________（答出两点即可）。
（4）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是________________________。

【推荐3】近年来，基因治疗(genetherapy)作为一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病。研究表明转基因水通道蛋白具有巨大的潜力，能帮助头颈部癌症幸存者克服慢性口干。水通道蛋白基因编码的蛋白质能促使细胞膜自然形成孔状的水通道，有利于推动流体，就好比唾液腺细胞分泌唾液进入口中。如图是研究人员构建的含水通道蛋白基因的表达载体，回答下列问题：

（1）若用限制酶XhoⅠ切下GDNF基因，并将之取代载体上相应的限制酶XhoⅠ～限制酶XhoⅠ区域（即100 kb），则所形成的重组载体长度为___________，该重组载体能否被限制酶XhoⅠ识别并切割开？_______。
（2）完成图中①过程，除了图中所示的必需工具外，还需要的工具酶是_______，该酶的作用是_______，常见的有____________和____________。
（3）形成图中重组载体所用的限制酶只能选择限制酶_______，经酶切后的载体与GDNF基因连接，可形成_______种含有二者的连接产物。

【推荐1】下表中列出了几种限制酶识别序列及其割位点，图一、图二中箭头表示相关限制酶的位点。请回答下列问题：

限制酶	BamH I	Hind Ⅲ	EcoR I	Sma I
识别序列及切割位点	↓ GGATCC CCTAGG ↑	↓ AAGCTT TTCGAA ↑	↓ GAATTC CTTAAG ↑	↓ CCCGGG GGGCCC ↑

（1） 一个图一所示的质粒分子经Sma I切割前后，分别含有___________个游离的磷酸基团。
（2） 若对图一中质粒进行改造，插入Sma I 酶切位点越多，质粒的稳定性越_____________。
（3） 用图中的质粒和外源ＤＮＡ构建重组质粒，不能使用Sma I切割，原因是____________。
（4） 与只是用EcoR I 相比较，使用BamH I和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________。
（5） 为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_______________。
（6） 重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____________。
（7） 为了从cDNA 文库中分离获取蔗糖转基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖的能力的大肠杆菌突变体，然后在________________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
（8）若将某一目的基因转入某一植物的核基因组中，确定该目的基因是否已整合到某一染色体上，方法之一是测定该染色体的___________________。

【推荐2】将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。请根据以下图表回答下列问题。

限制酶	Alu	EcoRI	PstI	SmaI
切割位点	AG↓CT	G↓AATTC	CTGCA↓G	CCC↓GGG
	TC↑GA	CTTAA↑G	G↑ACGTC	GGG↑CCC

(1)一个图1中所示的质粒S经EcoRI和SmaI切割后，形成的片段最多含有______个游离的磷酸基团。若对图1中的质粒S进行改造，插入的SmaI酶切位点越多，则质粒的热稳定性越______。
(2)在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是__________________________。
(3)PCR过程中设计一对与含有抗原基因DNA片段两端序列互补配对的引物(引物1和引物2称为引物对)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______位点。设计引物时需要避免引物之间形成__________而造成引物1与引物2相结合。
(4)重组质粒T(基因表达载体)的组成有：目的基因、启动子、___________、___________、复制原点，启动子的作用是____________。外源基因进入马铃薯细胞内并且维持稳定和表达的过程称为_______________。
(5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，如果采用EcoRⅠ、AluⅠ和PstⅠ酶切，会得到_________种DNA片段。
(6)抗原基因能否在马铃薯体内稳定维持和表达的关键是_____________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是____________________________。

【推荐3】大量研究表明，家畜的肉类产量与肌生长抑制素（MSTN）基因有关，MSTN蛋白在体内主要调控骨骼肌的生长发育。多种动物研究已经证实，敲除基因MSTN可以显著增加动物的肌肉质量。科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得敲除了基因MSTN的家禽。请回答下列问题：

(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1，Cas9酶可催化DNA分子的断裂，实现对目的基因的特异性切割，在切割过程中破坏的化学键是____________。图中向导RNA的作用是定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，其原理是____________。
(2)科研人员希望在鸡胚细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图2。

①在对向导RNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在其两端分别添加限制酶____________、____________的识别序列。
②用①中限制酶切割质粒和向导RNA对应的DNA片段，选择这种酶切方式的目的是____________。
③基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要连接的DNA片段是____________。
(3)将鸡胚分为三组并提取DNA，用图2中的引物Ⅰ和引物Ⅱ进行PCR扩增，并对PCR结果进行电泳检测，结果如图3。

1组电泳的结果小于2组，其原因是____________。3组电泳无结果，其原因是____________。

【推荐1】下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①—④表示相关的操作，E coRⅠ、Bam HⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题：

（1）上述过程中，需将目的基因插入到Ti质粒的___________片段上 才能整合到人参细胞的__________上，检测目的基因是否导入人参愈伤组织细胞的方法是___________。
（2）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了___________和___________序列，以便于后续的剪切和连接，PCR过程中要用到_________酶，至少需复制____次才可以获得____个单独的目的基因。
（3）过程②所构建的基因表达载体中启动子的作用是___________，过程③中需先用___________处理根瘤农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
（4）和用一种限制酶切割质粒和目的基因相比，用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割的优点是______。

【推荐3】如图所示，质粒PBR322上含有青霉素抗性基因（X^R）和四环素抗性基因（Y^R）．其中，X^R内部含有限制酶KasI识别序列，Y^R内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV识别序列，且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列．

（1）质粒PBR322的本质是_____。FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV中限制酶的作用特点是_____．
（2）NaeI酶切目的基因和质粒，加入DNA连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作。之后，受体细胞的类型包含_____
A．抗青霉素、抗四环素               B．抗青霉素、不抗四环素
C．不抗青霉素、抗四环素             D．不抗青霉素、不抗四环素
（3）若用KasI和FseI联合酶切上述重组质粒，则可能产生的酶切片段数_____。
A.2                      B．3                    C．4                       D．5
（4）动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是_____。
A．受精卵能使目的基因高效表达B．受精卵可发育成动物个体
C．受精卵基因组更易接受DNA的插入D．受精卵尺寸较大，便于DNA导入操作
（5）若目的基因模板链中的TGA序列对应1个密码子，翻译时识别该密码子的tRNA上相应的碱基序列是_____．通过筛选出的受体细胞内，目的基因能成功表达的原因是_____。

【推荐1】采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白（YCF1）（其基因序列内含有1个↓GATC一序列）基因导入受试杨树，并检测了相关指标。回答下列问题：
(1)通过生物信息学分离得到的YCF1基因可通过PCR进行扩增，扩增过程中DNA聚合酶具有____________的特点，某次PCR扩增产物电泳结果显示：实验组和对照组都没有任何条带，从引物角度分析可能的原因有___________。
(2)利用下图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用___________酶切割质粒，酶切后的载体和目的基因片段，通过__________酶作用后获得重组质粒。转入了重组质粒的受体菌，在分别含有四环素和氨苄青霉素的培养基中的生长情况分别为____________，从平板上长出的菌落中提取质粒利用Sau3AⅠ进行酶切，最多可以得到_______________种大小不同的DNA片段。
   

限制酶	BamHI	XmaI	BclI	SmaI	Sau3AI
识别序列 及切割位点	-G↓GATCC-	-C↓CCGGG-	-T↓GATCA-	-CCC↓GGG-	-↓GATC-

(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的______________导入大肠杆菌。研究者进一步获得了转YCF1基因的雄性不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是_________。

【推荐2】科学家尝试使用Cre/loxP位点特异性重组系统，在检测目的基因导入成功后，删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因。其技术过程如下(图中的■代表基因前的启动子)，据图回答：

(1)loxP是一种只有34个碱基对构成的小型DNA片段，是由两个13个碱基对反向重复序列和中间间隔的8个碱基对序列共同组成，自身不会表达，插入质粒后也不影响原有基因的表达，其碱基序列如下：
Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的________酶。从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒产生的结果相当于可遗传变异中的________。
(2)将重组质粒导入到植物细胞中最常用的方法是____________。作为标记基因，抗除草剂基因用于检测目的基因是否导入成功的原理是________。
(3)经检测成功后，抗除草剂基因已没有用途，继续留在植物体内可能会造成的安全问题是______________。经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开后，可得到如上图右侧的这两个DNA分子。由于__________________的原因，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。
(4)loxP序列是有方向性的。如果经Cre酶处理后，发现抗除草剂基因反向连接在质粒一上，则原来质粒一中这两个loxP序列的方向是________。
A．两个都是正向 B．两个都是反向 C．一个正向，一个反向 D．与方向无关

【推荐3】为获得具有抗玉米螟、抗除草剂草甘膦和抗旱性状的优良转基因玉米，科研人员把重组到同一植物表达载体的cry1ACM、epsps、GAT和ZmPIS转入植株，获得转基因植株。其中cry1AcM是抗玉米螟基因，epsps和GAT两个基因同时发挥作用时，能有效提高玉米植株抗御草甘膦的能力，ZmPIS是抗旱基因。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定，从大量转基因株系中优选出优良玉米株系。构建的基因表达载体部分示意图如下，请回答下列问题：

(1)构建基因表达载体时，需要的工具有___。
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，pUbi和P35S是___，其功能是___。
(3)将基因表达载体导入玉米受体细胞中最常用的方法是___，玉米细胞经植物组培获得植株，待植株长出新叶后喷洒含___的水溶液，选取存活植株移栽到温室，以获得具有除草剂抗性的植株。
(4)为检测抗旱基因是否导入玉米细胞，可采用___技术进行检测。除此之外也可采用PCR技术进行检测，在PCR反应体系中，应加入待测玉米细胞的___，抗旱基因的___种引物、dNTP等物质，若扩增后进行电泳时出现阳性反应，则导入成功。