【推荐3】HSV1是单纯疱疹病毒的一种类型，HSV1病毒颗粒的组装主要由包装信号序列（a′）介导。科研人员从HSV1基因组中分离出a′，利用基因工程技术构建了质粒pHSL并进行了相关实验（如图1），从而为某些神经系统疾病的基因治疗提供依据。请回答问题：

(1)从HSV1中分离a′时，将人工合成的含特定序列的核酸探针与含有目的序列的酶解片段进行_____，根据阳性信号逐步筛选出尽可能短的a′所在片段。
(2)构建质粒pHSL时，过程②需要用限制酶_____处理质粒pHSV和质粒pSK，处理后的产物经鉴定、纯化后用_____酶连接。
(3)步骤③将质粒pHSL导入大肠杆菌是因为质粒pHSL中含有_____，能在大肠杆菌细胞内复制而获得大量拷贝。
(4)Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。进行Vero细胞培养时，通常采用添加了_____等天然成分的基本培养基提供营养。
(5)tsK株是具有感染性的HSV1温度敏感株。在tsK株的辅助下，pHSL能组装成不含完整病毒基因组的颗粒（假病毒），获得含假病毒和tsK株的混合毒株。图2是Vero细胞连续传代过程中，混合毒株的滴度变化曲线及每代中假病毒所占的比例（柱形图）。据图分析，应选用_____代混合毒株用于后续神经细胞的接种实验，理由是_____。

(6)为验证假病毒能否感染体外培养的神经细胞并表达Laz基因，科研人员将混合毒株与大鼠神经细胞按一定比例在_____℃下混合培养48 h，用含_____（填物质名称）的检测液原位检测β半乳糖苷酶的活性，结果发现大约20%的细胞变蓝，说明_____。

【推荐2】野生型黑麦草细胞壁中较高的木质素含量会降低其作为青储饲料的品质。D蛋白是催化木质素合成的关键酶，某研究小组通过构建含D基因部分序列正、反向片段的表达干扰载体(如下图所示），在细胞内产生双链RNA分子，诱导D基因的mRNA持续降解，培育得到低木质素含量的黑麦草。回答下列问题：

(1)D基因的正、反向目的片段的克隆：提取野生型黑麦草叶片全部mRNA，______ 成cDNA。根据cDNA序列选取合适的片段，分别设计正、反向目的片段的上下游_______（相同/不同)酶切位点、引物，正向片段和反向片段引物的扩增序列_______（相同/不同），以使目的片段定向插入载体的特定位置。扩增产物经切下目的条带回收后与载体连接，形成克隆载体以用于正、反目的片段的扩增。
(2)构建D基因的表达干扰载体：
I.对含有正向片段的克隆载体和反向片段的克隆载体分别进行双酶切，将回收片段与经相同酶切的中间载体用_______酶进行连接，获得含有干扰片段的重组中间载体；为使干扰片段能在受体细胞中复制，中间载体需有_______。
Ⅱ.将干扰片段和超表达启动子插入Ti质粒的_______得到D基因的表达干扰载体，插入超表达启动子的目的是_______。
(3)导入和培养:将D基因的表达干扰载体导入农杆菌。黑麦草愈伤组织在菌液中浸没5min，先置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，再转入无菌水浸润的滤纸上共培养3天，共培养的目的是_______。筛选得到的愈伤组织经_______过程，培育得到再生植株。
(4)鉴定和筛选:对转基因植株与_______植株进行木质素含量测定与分析，筛选保留木质素含量显著_______的植株。