1 . PCR技术广泛用于对少量DNA样品的大量扩增过程中，尤其在法医鉴定中有重要的意义。PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）PCR技术的原理是_____________。PCR反应中需要加入缓冲液、引物、模板DNA、 ________、______。
（2）图中步骤1代表_______，步骤2代表_________，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（3）引物1和引物2的碱基序列__________（相同/不同）。若一个DNA分子在PCR中经历n轮循环，理论上需要消耗_______个引物,由引物形成子链的延伸方向是___________________。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会破坏__________之间的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但GC含量高的引物需要设定______________（更高/更低）的退火温度。如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有__________（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）。

2 . PCR技术的实用性和极强的生命力其使成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题：
(1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示：

   

①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCRI应选择图1中引物___________，大量扩增突变产物AD则应选择引物___________，重叠延伸时不需要引物的原因___________。
②重叠延伸PCR通过___________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是___________。
③若正常基因可被限制酶DpnI识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因：___________。
(2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。

   

①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是___________。
②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是___________（填“顺时针”或“逆时针”），PCR产物___________（填“含有”或“不含”）EcoRI的酶切位点。

3 . PCR技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测DNA等。完成下列有关PCR技术和相关应用的问题：
（1）在利用PCR技术扩增某DNA中的某一目的基因时，需要用到的酶是_____________，依据的原理是___________。 PCR技术可用于基因工程四个基本步骤中的__________和__________步骤。
（2）在影响扩增反应的各种因素中，引物的设计最为重要，引物的3′端应采用简并密码较少的氨基酸的对应核苷酸序列，否则会导致扩增的非特异性序列数量__________。
（3）PCR反应后期，由于_____________________（至少写两点）等原因，反应速率会降低。
（4）PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为__________，最终都会导致反应效率降低。退火温度过高则会因__________导致目标产物的量__________。 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1∶50~1∶100，在PCR反应的最初10~15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物__________个。