1 . 以下是有关冠状病毒的相关信息，请思考并回答：
（1）引起人类肺炎的某冠状病毒（nCoV）是一种单链RNA病毒，其跨膜表面糖蛋白（GP）是该病毒侵染宿主细胞的关键蛋白，科学家欲利用大肠杆菌作为受体菌批量生产GP以制备相关疫苗，研发疫苗要在短时间内大量快速生产探针可利用____________技术实现。从nCoV基因组中分离出的nCoV-GP基因不能直接与质粒重组，其原因是_____________________。
（2）为了使nCoV-GP基因和质粒构建基因表达载体，必须经过_____________形成____________再进行扩增两个过程，示意图如下。图示过程中需要的酶有_____________________________，需要添加的原料为__________________________，如果图中共有N个箭头（N>2），以DNA₁这条链为模板开始扩增，共消耗引物“”_______个，共产生由DNA₂和DNA₃两条链组成的DNA分子_________个。

（3）若第（2）问中实验操作没有失误，PCR反应却没有得到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号：①升高退火温度，②降低退火温度，③重新设计引物），请说明选择以上改进措施的原因___________________________。

2 . 金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

(1)从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______________获得目的基因
(2)在PCR反应体系中应加入模板DNA、引物、___________ 、 _______________、缓冲溶液等
(3)在PCR过程中，PCR的原理：_____________________。
(4)在设计引物时，引物要设计_________种、设计引物时还要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。
(5)图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。PCR过程中，经过4次循环得到__________个等长的DNA
(6)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破______________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
(7)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）。

3 . PCR技术广泛用于对少量DNA样品的大量扩增过程中，尤其在法医鉴定中有重要的意义。PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）PCR技术的原理是_____________。PCR反应中需要加入缓冲液、引物、模板DNA、 ________、______。
（2）图中步骤1代表_______，步骤2代表_________，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（3）引物1和引物2的碱基序列__________（相同/不同）。若一个DNA分子在PCR中经历n轮循环，理论上需要消耗_______个引物,由引物形成子链的延伸方向是___________________。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会破坏__________之间的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但GC含量高的引物需要设定______________（更高/更低）的退火温度。如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有__________（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）。

4 . （一）某食品公司得到一种高效酿酒的酵母菌菌株，并设计方案获得发酵产物。
(1)对于酵母菌的培养，比较适合它的培养基为________（A．马铃薯蔗糖培养基B．MS培养基C．LB培养基D．牛肉汤培养基），除了要选择合适的培养基成分外，还要考虑培养基中营养物质的_________。
(2)欲知道这种微生物的繁殖速度，可用涂布分离法或______________对酵母菌进行计数。对培养到某一时期的培养液制备成10^-5的稀释液，每次取0.1mL进行涂布分离，三个培养皿生长的菌落数依次为35个、32个、29个，则培养液中的酵母菌数量为______________个/mL。在恒温培养箱培养时，培养皿的放置方式如图______________（填“a”或“b”）。

(3)该酵母菌的发酵食品也会因为发酵时间的长短和______________不同，而形成不同的代谢产物，使发酵食品的风味发生变化。酿酒时会因为发酵液放置过久等原因，导致出现酸味，可能是因为产生了______________（填物质）。
（二）目前我国新冠病毒核酸检测的方法是RT-PCR，下图为RT-PCR（逆转录荧光PCR技术）的原理：PCR过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和淬灭基团（抑制荧光发出），当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光（荧光强度与探针水解量成正相关）。

请回答下列问题：
(4)PCR技术与DNA体内复制过程相比，两者的复制方式都是_______________。RT-PCR过程中，需先以RNA为模板合成cDNA，故装置中需添加______________酶。除了加酶，解开cDNA双螺旋的方法还有_______________。
(5)对新冠病毒进行检测时，探针是一段与______________相同的核苷酸序列。
(6)通过荧光检测到荧光信号，则可判定该检测样本为_______________性（选填“阳”、“阴”），在相同PCR循环次数条件下，荧光强度与病毒数量呈_____________。
(7)为了在没有条件进行核酸检测前及早发现新冠病毒，我国于2022年3月11日推出新冠病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是______________。试剂盒中的探针应采用______________技术生产。

5 . PCR技术的实用性和极强的生命力其使成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题：
(1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示：

   

①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCRI应选择图1中引物___________，大量扩增突变产物AD则应选择引物___________，重叠延伸时不需要引物的原因___________。
②重叠延伸PCR通过___________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是___________。
③若正常基因可被限制酶DpnI识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnI识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因：___________。
(2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。

   

①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是___________。
②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是___________（填“顺时针”或“逆时针”），PCR产物___________（填“含有”或“不含”）EcoRI的酶切位点。

7 . PCR技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测DNA等。完成下列有关PCR技术和相关应用的问题：
（1）在利用PCR技术扩增某DNA中的某一目的基因时，需要用到的酶是_____________，依据的原理是___________。 PCR技术可用于基因工程四个基本步骤中的__________和__________步骤。
（2）在影响扩增反应的各种因素中，引物的设计最为重要，引物的3′端应采用简并密码较少的氨基酸的对应核苷酸序列，否则会导致扩增的非特异性序列数量__________。
（3）PCR反应后期，由于_____________________（至少写两点）等原因，反应速率会降低。
（4）PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为__________，最终都会导致反应效率降低。退火温度过高则会因__________导致目标产物的量__________。 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1∶50~1∶100，在PCR反应的最初10~15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物__________个。