特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR基因，然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应，去除基因组上的kanR基因，进一步利用质粒的温敏特性将其消除，从而实现靶基因的敲除。下图是研究人员利用Cre/loxP敲除系统敲除谷氨酸棒状杆菌argR基因（精氨酸代谢的调控因子），获得高产精氨酸菌株的过程，其中kanR是卡那霉素抗性基因，cat是氯霉素抗性基因，HindⅢ、BanHⅠ是限制酶。请据图回答下列问题：_____ ，所需的酶是_____ 。
(2)下列引物1、引物2用于扩增argR基因上游序列，引物3、引物4用于扩增argR基因下游序列，下划线序列是相关限制酶识别序列，则HindⅢ、BamHⅠ的识别序列分别是_____ 、_____ 。
引物1：5'-GTCGACGGTATCGATAAGCTTAGGACTCAAACTTATGACTTCACAACCA-3'
引物2：5-CGCCCTATAGTGAGTCGTATTGGGATTTAAGTTTTCCGGTGTTGACG-3'
引物3：5'-CTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGTTAATCGCTTGTTAATGCAGGCA-3'
引物4：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCAAAGCCTCGTGAGCCTTAATC-3'
(3)②过程（融合PCR）是采用具有互补末端引物，形成具有重叠链的PCR引物，通过PCR引物重叠链的延伸，从而将不同来源的DNA片段连接起来。下列引物5、引物6用于扩增两端含loxP的kanR片段，引物5、引物6可分别与_____ 、_____ （引物1、引物2、引物3、引物4）重叠从而实现不同DNA片段的连接。
引物5：5'-CGTCAACACCGGAAAACTTAAATCCCAATACGACTCACTATAGGGCG-3'
引物6：5-TGCCTGCATTAACAAGCGATTAACGCGCAATTAACCCTCACTAAAG-3'
(4)④过程将质粒3导入_____ 态谷氨酸棒状杆菌，⑤过程在同源重组的作用下谷氨酸棒状杆菌株的argR基因被替换为_____ 片段。
(5)⑥过程导入质粒4的目的是_____ 。
(6)由于质粒4的温敏特性，⑦过程先在37℃条件下培养消除质粒4，然后用影印接种（A、B、C三个培养基中接种菌种的位置相同）培养验证其抗性，其结果如下图，则_____ 是目的基因被敲除的目的菌株。
(2)下列引物1、引物2用于扩增argR基因上游序列，引物3、引物4用于扩增argR基因下游序列，下划线序列是相关限制酶识别序列，则HindⅢ、BamHⅠ的识别序列分别是
引物1：5'-GTCGACGGTATCGATAAGCTTAGGACTCAAACTTATGACTTCACAACCA-3'
引物2：5-CGCCCTATAGTGAGTCGTATTGGGATTTAAGTTTTCCGGTGTTGACG-3'
引物3：5'-CTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGTTAATCGCTTGTTAATGCAGGCA-3'
引物4：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCAAAGCCTCGTGAGCCTTAATC-3'
(3)②过程（融合PCR）是采用具有互补末端引物，形成具有重叠链的PCR引物，通过PCR引物重叠链的延伸，从而将不同来源的DNA片段连接起来。下列引物5、引物6用于扩增两端含loxP的kanR片段，引物5、引物6可分别与
引物5：5'-CGTCAACACCGGAAAACTTAAATCCCAATACGACTCACTATAGGGCG-3'
引物6：5-TGCCTGCATTAACAAGCGATTAACGCGCAATTAACCCTCACTAAAG-3'
(4)④过程将质粒3导入
(5)⑥过程导入质粒4的目的是
(6)由于质粒4的温敏特性，⑦过程先在37℃条件下培养消除质粒4，然后用影印接种（A、B、C三个培养基中接种菌种的位置相同）培养验证其抗性，其结果如下图，则
更新时间：2022-04-25 11:19:04
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【推荐1】在遗传病监测及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：
(1) 在PCR中先用95 ℃高温处理的目的是________ ；而这一过程中在细胞内DNA复制时是通过________ 实现的。
(2) 在PCR技术中所需要的引物实质上是一种________ ，在相应的横线上写出引物Ⅱ________ 。
(3) 在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA：________ (写出①、②中的一种即可)。
(4) 若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________ 个引物。
(5) 在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是________ 。
(1) 在PCR中先用95 ℃高温处理的目的是
(2) 在PCR技术中所需要的引物实质上是一种
(3) 在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA：
(4) 若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入
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【推荐2】α抗胰蛋白酶可以治疗肺气肿等疾病。下图是科学家培育含人α抗胰蛋白酶因子基因(mAAT)的转基因山羊的流程图，请回答下列相关问题：
获取mAAT基因→构建基因表达载体→显微注射导入山羊受精卵→形成胚胎→将胚胎移入受体母羊→发育成转基因山羊
（1）利用PCR技术对mAAT基因进行扩增，前提是要有一段以mAAT基因的核苷酸序列为 模板合成的____ 。扩增过程中，该物质与DNA模板链的3’端结合，理由是____
（2）目的基因可以直接从生物体分离得到，也可以通过人工合成获取。请推测由mRNA反转录合成人α抗胰蛋白酶因子基因(mAAT)的大致过程：________________ （用文字和箭头表述）。
（3）构建基因表达载体的目的是________ 。为了使mAAT基因只在山羊乳腺中表达，需要在构建表达载体时在mAAT基因前端加上在乳腺中特异性表达的____ ，同时还需要有标记基因，其作用是____
（4）胚胎移植中，应选择有____ 的个体作为受体母羊，并对受体母羊进行同期发情处理。
获取mAAT基因→构建基因表达载体→显微注射导入山羊受精卵→形成胚胎→将胚胎移入受体母羊→发育成转基因山羊
（1）利用PCR技术对mAAT基因进行扩增，前提是要有一段以mAAT基因的核苷酸序列为 模板合成的
（2）目的基因可以直接从生物体分离得到，也可以通过人工合成获取。请推测由mRNA反转录合成人α抗胰蛋白酶因子基因(mAAT)的大致过程：
（3）构建基因表达载体的目的是
（4）胚胎移植中，应选择有
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【推荐3】果荚开裂并释放种子，是植物繁衍后代的重要途径。模式植物拟南芥果荚的开裂与传统油料作物具有相似的调控机制。研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。
（1）植物果荚开裂区域细胞的细胞壁在_________ 等酶的作用下被降解，导致果荚开裂。野生型拟南芥果荚成熟后会完全开裂，以便种子传播。
（2）研究者通过筛选拟南芥T-DNA插入突变体库，获得两个果荚不开裂的突变体甲和乙。检测发现突变体甲的M酶活性丧失，推测编码M酶的M基因由于插入T-DNA，突变为m基因。研究者利用不同的引物对，分别进行PCR，检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型，结果如图1 所示，验证了上述推测。在图2中标出引物1、2的位置及方向。_________
（3）进一步研究发现突变体乙的E酶活性丧失。另有一突变体丙的果荚开裂程度介于不开裂与完全开裂之间（中等开裂）。突变体乙、丙的果荚开裂程度分别由E/e、A/a基因控制。将上述突变体进行杂交，后代表型及比例如下表所示。
图3为甲与丙杂交所得F1的部分染色体示意图，基因M、m的位置已标出，在图3中标出基因E/e、A/a可能的位置_________ 。据上述信息，预测甲与乙杂交所得F1的表现型及比例为_________ ，F1自交所得F2的表现型及比例为_________ 。
（4）一些油料作物如油菜，若果荚过早开裂，会降低种子收获产量，从而影响经济收入。预测本研究成果在农业生产上的应用_________ 。
（1）植物果荚开裂区域细胞的细胞壁在
（2）研究者通过筛选拟南芥T-DNA插入突变体库，获得两个果荚不开裂的突变体甲和乙。检测发现突变体甲的M酶活性丧失，推测编码M酶的M基因由于插入T-DNA，突变为m基因。研究者利用不同的引物对，分别进行PCR，检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型，结果如图1 所示，验证了上述推测。在图2中标出引物1、2的位置及方向。
（3）进一步研究发现突变体乙的E酶活性丧失。另有一突变体丙的果荚开裂程度介于不开裂与完全开裂之间（中等开裂）。突变体乙、丙的果荚开裂程度分别由E/e、A/a基因控制。将上述突变体进行杂交，后代表型及比例如下表所示。
杂交组合 | F1表现型 | F2表现型及比例 |
乙×丙 | 完全开裂 | 完全开裂：中等开裂：不开裂＝9：3：4 |
甲×丙 | 完全开裂 | 完全开裂：中等开裂：不开裂＝2：1：1 |
图3为甲与丙杂交所得F1的部分染色体示意图，基因M、m的位置已标出，在图3中标出基因E/e、A/a可能的位置
（4）一些油料作物如油菜，若果荚过早开裂，会降低种子收获产量，从而影响经济收入。预测本研究成果在农业生产上的应用
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【推荐1】下图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X—gal变为蓝色，Amp为氨苄青霉素抗性基因。图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。请回答下列问题：
（1）若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有_________________ 和_________________ ，构建重组质粒时需要的工具酶有_________________ ，对获取的目的基因可用_________________ 技术对其扩增。
（2）实验小组用BamH I和Blg II两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了_____________ 。
（3）将若干个质粒和目的基因用BamH I和BlgII两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，然后再用BamH I和EcoR I切割成功连接后的重组质粒，可以获得了_________ 种长度的DNA片段。
（1）若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有
（2）实验小组用BamH I和Blg II两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了
（3）将若干个质粒和目的基因用BamH I和BlgII两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，然后再用BamH I和EcoR I切割成功连接后的重组质粒，可以获得了
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【推荐2】成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 是一种调节机体代谢的分泌型蛋白，具 有降低血糖、提高胰岛素敏感性等生理活性。但由于 FGF21 稳定性差，导致 FGF21 药效较差。科研人员以含有 FGF21 基因 (F) 的重组质粒 pSUMO-FGF21(p-F)为 模板，对 F 进行定点突变，构建含突变基因的突变质粒 pSUMO-mmtFGF21(p-mF)， 从而实现对FGF21 的改造，部分过程如下图所示。
回答下列问题：
(1)改变FGF21 中的氨基酸，使某两个氨基酸R 基之间形成共价键，可提高FGF21 的 稳定性。这首先需要在数据库中检索 FGF21 的氨基酸序列和__________ ，据此设计__________ 并对蛋白质结构进行模拟验证。
(2)通过PCR 可实现对FGF21 基因 (F)的定点突变。
①应选择下图中的哪对引物进行定点突变__________
A.1 和4 B.2 和 3 C.1 和 3 D.2 和4)
②突变引物长度不能过短，否则会由于__________ ，突变失败。
③将引物、 p-F、缓冲液、无菌水、 DNA 聚合酶和__________ 等加入微量离心管中，构 成PCR 体系进行反应。
(3)限制酶DpnI 可识别并切割腺嘌呤被甲基化的5'-GATC-3'序列。选择突变质粒时， 将Dpn I 与 PCR 产物混合，置于37℃下处理1h， 可使 p-F 被切割而p-mF 不被 切割，原因是__________ 。为确保p-F 被充分切割，可适当增加酶量或__________ 。
(4)在转化大肠杆菌时，用低温和 CaCl₂ 溶液处理大肠杆菌细胞，使其成为__________ 细胞， 与酶切产物混合后置于冰上30分钟，再通过短暂热刺激处理，使质粒进入细胞中。 最后取适量菌液涂布在__________ (填“含”或“不含”)背霉素的平板上进行筛选。 当平板上长出菌落则表明发生了突变。为证实这一结果，可随机挑取单菌落抽提质粒并进行__________ 。
回答下列问题：
(1)改变FGF21 中的氨基酸，使某两个氨基酸R 基之间形成共价键，可提高FGF21 的 稳定性。这首先需要在数据库中检索 FGF21 的氨基酸序列和
(2)通过PCR 可实现对FGF21 基因 (F)的定点突变。
①应选择下图中的哪对引物进行定点突变
A.1 和4 B.2 和 3 C.1 和 3 D.2 和4)
②突变引物长度不能过短，否则会由于
③将引物、 p-F、缓冲液、无菌水、 DNA 聚合酶和
(3)限制酶DpnI 可识别并切割腺嘌呤被甲基化的5'-GATC-3'序列。选择突变质粒时， 将Dpn I 与 PCR 产物混合，置于37℃下处理1h， 可使 p-F 被切割而p-mF 不被 切割，原因是
(4)在转化大肠杆菌时，用低温和 CaCl₂ 溶液处理大肠杆菌细胞，使其成为
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【推荐3】1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：
(1)在人体胰岛B细胞内，图1中前胰岛素原形成具生物活性的胰岛素过程中参与的细胞器有__________ 。
(2)由于密码子具有______ ，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。____ （填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(3)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶__________ 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’______ 3’。
(4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用__________ 法将大肠杆菌接种到添加了__________ 的培养基上筛选出__________ 色的菌落即为工程菌种。
(5)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发_____ 推测应有的氨基酸序列________ 。
(1)在人体胰岛B细胞内，图1中前胰岛素原形成具生物活性的胰岛素过程中参与的细胞器有
(2)由于密码子具有
(3)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶
(4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用
(5)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发
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解题方法
【推荐1】华南农业大学科研团队首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白质——人神经生长因子(hNGF)，为生产高活性的人类药用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用。图示为该团队构建的基因表达载体，请回答下列相关问题：
(1)科研人员曾经利用小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源神经生长因子(mNGF)及大肠杆菌表达的hNGF进行一些神经损伤疾病的治疗，但其治疗效果均比人体自身合成的hNGF差。请分析mNGF治疗效果较差的原因可能是___________ ，导致mNGF的活性较低；大肠杆菌表达的hNGF治疗效果也较差的原因可能是___________ ，导致大肠杆菌表达的hNGF活性也较低。
(2)家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是___________ (答出两点)；在构建hNGF基因表达载体时，需将hNGF基因与___________ 等控制元件重组在一起，通过___________ 技术将基因表达载体导入猪的受精卵中，经___________ 等技术将受精卵培养成胚胎并转移到受体猪体内。
(3)为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还可以进行个体水平的鉴定，具体的方法是___________ 。
(1)科研人员曾经利用小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源神经生长因子(mNGF)及大肠杆菌表达的hNGF进行一些神经损伤疾病的治疗，但其治疗效果均比人体自身合成的hNGF差。请分析mNGF治疗效果较差的原因可能是
(2)家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是
(3)为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还可以进行个体水平的鉴定，具体的方法是
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【推荐2】PCR定点突变技术是最常用的基因突变技术，通过定点诱变可以在体外改造DNA分子。重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术，操作过程如图1，可通过测序来检验定点突变是否成功。现欲将改造后的基因构建重组质粒导入大肠杆菌，质粒结构如图2。
回答下列问题：
(1)PCR的原理是_______________ ；图1所示重叠延伸PCR中，第1对引物是_______________ ；在第1对引物组成的反应系统和第2对引物组成的反应系统中各进行一次复制，可产生_______________ 种DNA分子。
(2)图1所示DNA分子不能延伸，原因是_______________ 。
(3)分析图1和图2，要将突变的基因定向插入质粒并构建表达载体，应如何设计通用引物FP1和通用引物RP2？_______________ 。
(4)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图3），培养基A中应添加_______________ ，培养基B中应添加_______________ ，含有重组质粒的菌落是_______________ （填写数字）。
回答下列问题：
(1)PCR的原理是
(2)图1所示DNA分子不能延伸，原因是
(3)分析图1和图2，要将突变的基因定向插入质粒并构建表达载体，应如何设计通用引物FP1和通用引物RP2？
(4)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图3），培养基A中应添加
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(0.4)
【推荐3】(三）生物技术及生命科学的应用
严重联合性免疫缺陷症是一种T淋巴细胞缺乏腺苷脱氨酶（ADA）引起的疾病，通过基因工程的方法将正常ADA基因导入患者细胞中进行治疗。如图分别表示正常ADA基因、金属硫蛋白基因（含有该基因的细胞能在含重金属镉的培养基中生长）和质粒（总长为3.8kb，lkb=1000对碱基），ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ均为限制酶。
1．基因工程的理论依据是不同生物______________ 。
A. 细胞结构相同 B. DNA结构相同
C. 都遵循中心法则 D. 共用一套密码子
2．为了筛选含有目的基因的受体细胞，需要先将目的基因和标记基因连接形成融合基因。首先用限制酶__________ 切割正常腺苷脱氨酶基因与金属硫蛋白基因，然后用__________ 酶将它们连接形成融合基因。
3．将上述融合基因与图的质粒构建成重组质粒时，应选用的限制酶是____________ 。
A. ClaⅠ B. SacⅠ和XbaⅠ C. ClaⅠ和XbaⅠ D. ClaⅠ和SacⅠ
4．若该融合基因长1.9kb，据图分析，此重组质粒大小为_______ kb。
5．重组质粒应导入的受体细胞是病人的__________ 细胞。为筛选出含重组质粒的受体细胞，需在培养基中添加的物质是____________ 。
严重联合性免疫缺陷症是一种T淋巴细胞缺乏腺苷脱氨酶（ADA）引起的疾病，通过基因工程的方法将正常ADA基因导入患者细胞中进行治疗。如图分别表示正常ADA基因、金属硫蛋白基因（含有该基因的细胞能在含重金属镉的培养基中生长）和质粒（总长为3.8kb，lkb=1000对碱基），ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ均为限制酶。
1．基因工程的理论依据是不同生物
A. 细胞结构相同 B. DNA结构相同
C. 都遵循中心法则 D. 共用一套密码子
2．为了筛选含有目的基因的受体细胞，需要先将目的基因和标记基因连接形成融合基因。首先用限制酶
3．将上述融合基因与图的质粒构建成重组质粒时，应选用的限制酶是
A. ClaⅠ B. SacⅠ和XbaⅠ C. ClaⅠ和XbaⅠ D. ClaⅠ和SacⅠ
4．若该融合基因长1.9kb，据图分析，此重组质粒大小为
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