【推荐1】阅读下面关于“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要，请回答：
本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素，所用的人胰岛素基因是根据植物“偏爱”的密码子设计，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成。将该基因置于CaMV³⁵S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。并且在胰岛素-COOH端加上KDEL内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。
（1）根据上述专利摘要，本发明中所用的人胰岛素基因是采用的_____方法获得，获得的目的基因与人体细胞中胰岛素基因的碱基序列_____ （相同/不同）。
（2）本发明中，将目的基因导入受体细胞的方法是_____，载体上的T-DNA可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
（3）吃这种转基因番茄能否治疗人类的I型糖尿病？_____ （能/不能）。原因是：_____。
（4）某公司始终秉承“绿色庄园、生态产业、健康生活”的发展理念，着力打造全产业链现代新概念农业庄园。雇佣农民种植农民转基因番茄，农民既有土地和房屋租赁收入，又有工资收入。公司的这一措施主要体现了生态工程的_____原理。
（5）生物技术是一把双刃剑，可以造福人类，使用不当会给人类带来灾难，目前我国是种植转基因作物最多的国家，有关安全性的争议越来越多，转基因生物安全性问题主要涉及以下三个方面：_____、_____、_____。

【推荐2】补充正常凝血因子F₈可以治疗甲型血友病，因此可以利用转基因技术人工生产F₈。某种大肠杆菌的质粒中含有β-半乳糖苷酶α片段序列（图1），大肠杆菌的DNA分子中则含有β-半乳糖苷酶ω片段序列（图1），由于天然大肠杆菌同时具备这两种片段序列，可以使培养基中含有X-gal底物转变成蓝色产物，当缺少任意一个α或ω片段序列，X-gal底物不能转变成蓝色产物。HindIII、EcoRI、BamHI分别为三种限制性内切酶，如图3中箭头所指为三种限制酶的切点。

1．要筛选出转基因菌种，应选用的限制酶是_____，选择的依据是_____。
2．根据下图判断，限制酶作用于DNA的部位是。

A．①

B．②

C．③

D．④

3．控制F₈的基因也可以通过人体细胞相应的mRNA来完成，该合成的过程称为_____。
4．若要筛选出含重组质粒的大肠杆菌，培养基中需要加入物质_____。（多选）
A．青霉素          B．四环素          C．X-gal          D．伊红美蓝
在配置培养基时，进行称量、溶解、定容后，还需要进行的操作为_____、灭菌。
5．在基因工程的筛选过程中，若培养基中出现较多的蓝色菌落，请解释原因：_____。

【推荐3】用基因工程技术从分离、提纯的圆褐固氮菌中获取固氮基因，然后进行PCR扩增。表1和表2分别表示用PCR扩增固氮基因的反应体系及反应条件。
表1

PCR反 应体系	缓冲液	脱氧核苷酸	引物A	引物B	DNA聚合酶	模板DNA
50 μL	5 μL	0.5 μL	0.5 μL	0.5 μL	0.5U	1～2 μL
加去离子水补足至50 μL

表2

反应 条件		复性	延伸	30次循环后	保温
	温度	55 ℃	72 ℃	适宜	4 ℃
	时间	30 s	1 min	5～10 min	2 h

(1)从表1和表2中可得出，PCR技术与DNA复制相比较，主要区别之一是__________。此外，从反应条件看，所使用的DNA聚合酶应具有____________________________________的特点。每次循环都需要2种引物的主要原因是______________________________________________。
(2)在对固氮基因产物的生产研究中，需要从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质。下图表示蛋白质提取和分离实验涉及的相关原理。      　

①图甲表示相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶色谱法分离的过程。试管中收集到的液体最先出现的是相对分子质量较大的蛋白质，原因是_________________________________________。
②图乙所示实验模拟电泳现象，U型管左侧的颜色逐渐变深，原因是_____________________。

【推荐1】某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，它们的识别序列和黏性末端各不相同。质粒同时也含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示，请回答下列问题。

（1）将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种变异属于________。
（2）如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能________________________________。
（3）在构建重组质粒时，应选用________和________两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
（4）基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，下图表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入了农杆菌。

培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有________、________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________（填数字）菌落中的细菌。为了确定抗盐烟草是否培育成功，既要用__________标记的含抗盐基因的DNA片段作探针进行分子杂交检测，又要用______________的方法从个体水平鉴定烟草植株的耐盐性。
（5）将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用________技术，愈伤组织经________进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加______。

【推荐2】单克隆抗体技术在疾病诊断和治疗以及生命科学研究中具有广泛的应用。如图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。
   
(1)制备单克隆抗体利用的生物学技术有_______。
(2)制备单克隆抗体所用的B淋巴细胞一般从脾中采集，然后用______（动物细胞特有）诱导，使B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，细胞融合实验完成后，融合体系中含有未融合的细胞和______种杂交细胞（只考虑两个细胞融合），体系中出现多种类型细胞的原因是_______。
(3)生产单克隆抗体时涉及两次筛选，第一次用选择培养基选出_______，第二次筛选是选出_______，第二次筛选所采用操作技术依据的原理是______。
(4)单克隆抗体还可以用下面方法制备：

   
prG能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体时，Ⅰ最可能是______细胞。某人利用图（a）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因（prG）的重组DNA，如图（b）所示。这三种重组DNA中，目的基因能在宿主细胞中正确表达的有______。
   

【推荐2】大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的载体。某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出半乳糖苷酶。当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。请分析并回答下列问题：

（1）对已获得的目的基因可利用_____技术进行扩增。
（2）目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复_____键。
（3）将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是_____；大肠杆菌需事先用进行处理，目的是_____。
（4）将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质_____和生长因子，还应加入IPTG、X-gal以及氨苄青霉素，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出_____。
（5）若观察到培养基上出现_____色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是_____。

【推荐3】叶绿体是植物基因工程的理想受体，将外源基因整合到叶绿体DNA中往往能够获得高效表达，由此发展出叶绿体基因工程。回答下列问题：
（1）叶绿体基因工程的核心是构建基因表达载体，表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点、______等。启动子的作用是___________识别和结合的位点。
（2）叶绿体DNA上的基因在结构和表达方式等方面有原核细胞基因的特性，若目的基因来源于真核生物，则往往选用目的蛋白对应的是______________（填“cDNA片段”或者“基因组DNA片段”）作为目的基因。
（3）将目的基因导入烟草细胞叶绿体时，要穿过多层生物膜，因而常将包裹在金属颗粒表面的表达载体轰击进入叶绿体，提高转化效率，该方法称为____。
（4）外源基因通常被定点整合到叶绿体DNA的非基因序列中，这样做的目的是____________________
（5）转入叶绿体中的基因不随花粉传递给子代，理由是________

【推荐1】抗菌肽是一类具有广谱抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,细菌不易对其产生耐药性且无残留等,被认为是理想的抗生素替代品。为了突破抗菌肽在畜禽养殖业广泛应用的瓶颈，我国研究人员运用小分子泛素蛋白（SUMO）融合技术将含有重组抗菌肽LLv基因的质粒导入大肠杆菌，表达融合蛋白SUMO-LLv,并优化了表达条件,从而能高效获得重组抗菌肽 LLv。所用质粒含有卡那霉素抗性基因(Kan^R)、LacZ基因及SacⅠ、XhoⅠ酶切位点等，其结构和构建重组质粒的过程如图1所示。据此分析回答以下问题：

注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
(1)扩增LLv基因时，PCR反应体系中含有的酶有_____________；已知该基因序列不含图1中限制酶的识别序列，为了使其能与已被酶切的质粒连接，需根据__________设计引物。
(2)LLv基因以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。该基因内部没有SacⅠ、XhoⅠ这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是_____________。
(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，需用CaCl₂处理大肠杆菌，其目的是__________________。
(4)为了将成功导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来，甲同学在添加了卡那霉素、X-gal等成分的培养基中进行接种，结果如图2，该同学采用的接种方法是______________。图2中出现的_____菌落即成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落，判断的理由是________________。

【推荐2】荧光蛋白GFP在紫外线或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可以用于检测细胞中目的基因的表达。科研团队将人β-酪蛋白基因与GFP基因连接，获得了β-酪蛋白-GFP融合基因（简称甲），将其插入质粒P0，构建了基因表达载体P1，其部分结构如图所示，图中E1、E2为两种限制酶酶切位点。回答下列问题：

(1)构建融合基因甲时需要将β-酪蛋白基因编码链（转录时与模板链互补的DNA单链）的___端与GFP基因编码链的___端相连。为保证甲的完整性及其与质粒PO正确连接，实验中选择的限制酶E1和E2必须满足的条件是___（答两点）。基因表达载体P1除了具有图示结构外，还应具备的结构有___。
(2)若编码β-酪蛋白的DNA片段序列是：5′-TTCGCTTCT……CAGGAAGGA-3′，扩增该基因时，在PCR仪中加入的引物的碱基序列为___。
(3)科研团队将P1转入山羊乳腺细胞后，在该细胞中观察到了绿色荧光。为获得能生产β-酪蛋白的山羊，还应该完成的主要工作包括：将能够产生绿色荧光的___移入___中，体外培养至___时期，再进行胚胎移植等。其中，进行体外胚胎培养时所需的气体环境是___。
(4)检查生产人β-酪蛋白的转基因山羊是否培育成功，还需要进行分子水平的检测，利用PCR技术可以检测___（答两点）。

【推荐3】江苏某研究团队利用TetR和GFP两种基因，构建了监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”大肠杆菌工程菌。限制酶的识别序列及切割位点、TerR和GFP两种基因所在的DNA片段以及相关的载体如图1所示，监测原理如图2所示。天然大肠杆菌中不具备TerR、GFP和Amp^r（青霉素抗性基因）这三种基因。请据图回答下列问题：

限制酶	EcoRI	XbaI	SpeI	BamHI
识别序列及切割位点

(1)基因工程的核心工作是___。若要拼接DNA片段1和2，结合图1中信息，在___酶作用后再添加___酶，可拼接成功。成功拼接后的连接处碱基序列为___（按5'→3'的顺序只写一条链）。最终构建成功的重组质粒示意图是___（填字母）。

A.   B.   

C.       D.

(2)在上述研究中，需导入天然菌的基因有___（编号选填）。
①四环素合成相关基因②GFP基因③TetR基因④RNA聚合酶基因
(3)据图2分析，该工程菌检测环境中四环素水平的原理是___。
(4)下列操作不能证明重组质粒和大肠杆菌工程菌建构成功的方法及现象有___。
a．通过琼脂糖凝胶电泳实验证明重组质粒的大小符合预期
b．大肠杆菌工程菌不能在含有青霉素的培养基上生长
c．用显微镜观察重组质粒上的外源DNA片段的碱基序列
(5)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP蛋白的第65位丝氨酸替换成苏氨酸，该项技术属于___。