【推荐1】血管紧张素转化酶Ⅱ（ACE2）与高血压发生密切相关，该基因的开放阅读框cDNA序列大小为2418bp（图1）。甲、乙两位同学通过分子生物学方法克隆该基因到pMD18-T质粒载体中（图2），各自的部分测序结果如图4，通过双酶切获得ACE2基因编码序列与pEGFP-N1（图2）表达载体重组（MCS多酶切位点序列如图3所示），然后将重组质粒转染到受体细胞中，进行目的基因ACE2与绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达，最后实验结果显示甲、乙两同学培养的细胞均没有检测到绿色荧光蛋白。试分析并回答下列问题：
         
   
(1)若用PCR技术获取目的基因，则与之对应的引物结合部位应该是基因的_______端，该技术过程中会将温度调整到72℃左右的目的是________；该DNA分子在PCR仪中经过5次循环，需消耗的引物数量共_____个。
(2)根据图2可知，两种载体都具有的基本结构有_______、________和限制酶切位点。
(3)载体中Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，其在基因工程中的主要作用有_______。
(4)乙同学利用目的基因ACE2与绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的培养细胞没有检测到绿色荧光的原因是________。

【推荐2】虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能，杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素，科研人员将BKT基因和CRTR-B基因导入杜氏盐藻，构建杜氏盐藻细胞工厂高效生产虾青素。
(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA为模板，设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因，此过程需要____________酶的催化。

   

(2)构建转化载体：“无缝克隆法”是构建重组质粒的新方法，指利用同源重组酶将末端具有一致同源序列的线性化载体和目的基因连接形成重组质粒，图1表示利用“无缝克隆法”向质粒中插入抗除草剂基因的基本过程。
Ⅰ．PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的__________端添加对应的同源序列。若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则所需引物（5'-3'）的序列应为：_______。
A．同源序列+特异性扩增引物序列+限制酶识别序列
B．同源序列+限制酶识别序列+特异性扩增引物序列
C．特异性扩增引物序列+限制酶识别序列+同源序列
Ⅱ．科研人员利用“无缝克隆法”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增BKT基因所用的引物为__________；扩增CRTR-B基因所用的引物为___________；
Ⅲ．最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是_____________；
IV．与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法”具备的优势有________（2分）
(3)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，用含__________的培养基筛选已转化的杜氏盐藻，通过相关技术检测目的基因是否成功表达。
(4)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高_____________；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免__________。

【推荐1】图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因（抗冻基因）番茄的示意图，外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因。请回答下列问题：
   
(1)图甲中通常选用质粒C构建重组质粒，不选用质粒A和B的原因分别是_____、_____。
(2)据图乙分析，若成功构建重组质粒以利于筛选鉴定，应优先选用两种限制酶_____切割目的基因和质粒，采用两种限制酶的优点是_____。农杆菌中的Ti-质粒应含有T-DNA，其作用是_____。在构建基因表达载体过程中常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在目的基因上游，双启动子的作用可能是_____。
(3)图丙中的A链和B链来自于AFPs基因。欲利用PCR技术对AFPs基因进行扩增，需要添加_____酶，应选取的引物是_____，循环4次需要的引物数量是_____个。
   
(4)为使改造后的AFPs基因能够表达，人工设计质粒D并对它的多个酶切位点进行研究。若用HindⅢ酶或KpnI酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRI酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnI酶和EcoRI酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位点为计算起点，则KpnI酶切割位点与HindIII酶切割位点最短长度为_____，EcoRI酶的两个切割位点与HindⅢ切割位点的最短距离为_____。

【推荐2】5月13日起，全程只需打一针的腺病毒载体重组新冠疫苗已经在上海开始接种了，该疫苗由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生物工程研究所陈薇院士团队研发。该疫苗研发原理是：剔除腺病毒中与复制相关的基因，使其不能增殖，同时插入新冠病毒外壳上的棘突蛋白（S蛋白）基因。重组疫苗进入人体后，S蛋白基因可在体内表达出新冠病毒棘突蛋白。激发机体产生S蛋白抗体和记忆细胞，请回答下列问题：
（1）扩增S蛋白基因要用到PCR技术，PCR是___________________的缩写，反应需在一定的缓冲溶液中进行，除需要模板、原料外，还需要_________________种引物和________________。扩增循环一次依次分为变性、________________和________________三步。
（2）在构建基因表达载体时，在S蛋白基因的上游与下游需要分别具有__________、________。
（3）与S蛋白抗体的合成和运输有关的有膜细胞器是_______________________。
（4）该疫苗与灭活或减毒的疫苗相比会更安全，原因是_____________。

【推荐3】图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，且限制酶的切点是唯一的，外源DNA插入会导致相应的基因失活，请回答下列问题。

（1）基因工程中最常用的载体是_______，而作为基因表达载体，除图1所示结构外，还需具有___________________________。
（2）根据图中所给信息，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是__________________。若将基因表达载体导入大肠杆菌，一般用____________处理，使其处于_____________，以利于吸收周围环境中的DNA分子。
（3）为了筛选含目的基因的大肠杆菌，应在培养基中添加______________，培养一段时间后，平板上长出的菌落，用PCR技术鉴定时，所用的引物组成为图2中_____________。

【推荐1】人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y）。该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取_____________作为模板，在_____________催化下合成cDNA。再利用_____________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是_____________，将上述所得Y的基因插入_____________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用该转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经_____________得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_____________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是_____________。

【推荐2】人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：

(1)htPA基因与载体用______限制酶切割后，通过___连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用________技术。
(2)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其________。采集的精子需要经过____________，才具备受精能力。
(3)将重组表达载体导入受精卵常用的方法是____________。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的________。
(4)若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到________，说明目的基因成功表达。
(5)实际操作中最常用_______法将重组质粒导入植物受体细胞。种植转基因植物，它所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。把目的基因导入植物的_______DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是_________。

【推荐3】马铃薯在栽培过程中容易遭受病毒的侵染而导致减产。如图表示转基因抗病毒马铃薯植株培育的过程示意图，请回答下列问题。

(1)在获取目的基因过程中，常使用特定的限制酶，这是因为限制酶能识别____________序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________断开。
(2)在获得目的基因后，常采用PCR技术对目的基因进行扩增，该技术的原理是____________；利用该技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便____________。
(3)在重组质粒中，除目的基因外，还必须有启动子、______，其中启动子的作用是____________。
(4)检测重组细胞内是否转入目的基因，常采用DNA分子杂交技术、该技术中需要使用基因探针，请写出制备基因探针的简要操作过程：________________________。

【推荐1】治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥反应具有重要意义，基本过程如下：

（1）过程①②依次采用了细胞工程的_________技术及胚胎工程的早期胚胎培养技术，图中采集到的卵母细胞必须培养到__________________（填时期）才能去除细胞核。
（2）进行动物细胞体外培养，首先应保证被培养的细胞处在____________的环境中，此外，应___________，以便清除代谢产物，防止________________________________。
（3）据图可知胚胎干细胞可取自囊胚的_________________，由于胚胎干细胞在功能上具有发育的全能性，即____________________________________________________________________。若将图中获得的组织器官移植给______________________（填“个体A”或“个体B”），则发生免疫排斥反应的可能性很小。

【推荐2】哺乳动物单倍体胚胎干细胞技术是遗传学研究的新手段，该项技术为研究隐性基因功能提供了理想的细胞模型。下图表示研究人员利用小鼠获取单倍体胚胎干细胞的简要流程，回答下列问：。

(1)方法一中，研究人员需对实验小鼠注射促性腺激素，使其____________，从而获得更多的卵母细胞，在体外选用特制的培养液经过早期胚胎培养至囊胚期，并从____________中分离、筛选出胚胎干细胞。采用这种方法获得的单倍体胚胎干细胞称为孤雌单倍体胚胎干细胞（PG-haESCs）。
(2)采用方法二中，研究人员用____________方法去除细胞M中的雌原核，再对处理后的细胞进行进一步的培养、分离和筛选，即可得____________单倍体胚胎干细胞（AGhaESCs）。
(3)研究发现，小鼠单倍体胚胎干细胞存在自发二倍体现象，对此可以通过测定分析细胞内____________分子的含量，或利用____________观察处于____________期细胞的染色体数目进行确定。
(4)2016年，中国科学院动物研究所周琪实验室通过细胞融合技术将小鼠孤雄（雌）单倍体干细胞和大鼠孤雌（雄）单倍体干细胞融合，创造出一种新型的干细胞——异种杂合胚胎干细胞。此小鼠—大鼠杂交细胞中通常含有________个染色体组，该技术突破了有性杂交的局限，使____________成为可能。
(5)研究发现，单倍体胚胎干细胞也能分化，形成不同功能的细胞、组织和器官，该技术培育的单倍体动物可成为研究____（填“显性”或“隐性”）基因功能的理想细胞模型。

【推荐3】克隆猫“大蒜”的本体是一只英国短毛猫，它是我国首例完全自主培育的克隆猫。它的本体陪伴了主人近三年的美好时光后，因泌尿系统疾病去世，它的主人找到相关机构，成功克隆出了“大蒜”延续这一份陪伴，下图是克隆猫“大蒜”的培育过程示意图，回答下列问题：

（1）从去世不久的“大蒜”本体腿部取得表皮细胞，在构建重组细胞前需进行动物细胞培养，培养时首先要保证_____的气体环境，其中CO₂的主要作用是_____，此外还需要定期更换培养液，原因是_____。
（2）去除卵母细胞的细胞核采用_____法，通过_____法使两细胞融合。
（3）克隆猫“大蒜”和它之前的本体在外貌上有一定的细微差别，从遗传物质角度分析，这是因为_____。
（4）重组细胞培养的克隆胚胎在移植之前要对代孕猫进行_____，胚胎在代孕猫体内存活的生理学基础是_____。