【推荐3】为了应对干旱和强降雨等灾害性天气，很多城市增设了雨水截流储存和利用的设施，如布设于道路周边或地势较低区域的生物滞留池。生物滞留池内多含高浓度的污染物，其中的多环芳烃（PAHs）会严重危害城市水环境。我国高校的科研团队通过多年研究，对生物滞留池内的土壤微生物进行群落分析，从中筛选出土壤的耐PAHs的优势菌，再通过基因工程技术导入PAHs的降解基因，成功培育出土著的、高效降解PAHs的优良菌株。下图为土著优势菌的筛选过程图，请完成下列问题：

(1)首先进行富集培养，先将10g生物滞留池表层土壤加入到液体培养基中，振荡培养48h。培养基以_____作为唯一碳源。接着将富集培养液进行上图所示操作，其中X溶液为_____。若用上图接种方法培养了3个培养皿，菌落数分别为163个、158个、159个，则可推测富集培养后的菌液中每毫升土壤优势菌数为_____个。
(2)进一步发现，分离得到的菌株中均没有降解PAHs的能力，分析其原因可能是_____；进一步实验发现，这些菌株虽然没有降解PAHs的能力，但都体现了较强的耐受PAHs的能力。进一步分离培养，从中筛选出一株对PAHs具有良好耐受能力的菌株Y1，作为土著优势菌进行接下来的基因工程改造。
(3)研究团队发现，RHD基因是优良的PAHs降解基因，为实现RHD基因成功导入菌株Y1，并利用绿色荧光蛋白基因Gfp起到一定标识作用，研究团队通过设计特定引物，采用重叠PCR（两种基因的引物碱基互补配对）的方式将RHD基因与Gfp基因进行融合，得到RHDGfp基因。所需引物如下：

①由上图可知引物_____与引物_____完全重叠互补，在进行重叠PCR时可以将两条目的片段进行连接，得到RHDGfp融合基因。在RHDGfp融合基因两端加入了特定限制酶的酶切位点，方便后续与质粒构建表达载体。
②将构建好的质粒—RHDGfp融合基因表达载体导入菌株Y1，通过培养后显微镜观察，可见重组菌体Y1＇发出明显的绿色荧光，表明_____。
(4)请你写出一个该研究团队还需研究的方向：_____。

【推荐3】凝乳酶具有凝乳和水解蛋白质的功能，由于能使奶制品形成特殊的风味，在酸奶和奶酪的生产中被广泛应用，传统凝乳酶是从未断奶的小牛胃液中提取的。科研人员欲制备产凝乳酶的工程菌用于发酵工程，以满足奶业生产的需求。回答下列问题。
(1)从牛体内直接获取凝乳酶基因比较麻烦，一般是在牛的乳腺细胞中提取凝乳酶基因的mRNA，在_____酶催化下获得DNA（cDNA），cDNA与凝乳酶基因不同，由于缺少_____，直接导入受体细胞是不能表达的。
(2)图1为凝乳酶cDNA（目的基因），图2为质粒pUC18示意图。   

对凝乳酶cDNA通过PCR进行扩增时选择的引物组合是_____，扩增时缓冲液中需要添加Mg²⁺，原因是_____。为了能让目的基因和质粒pUC18能正确连接，扩增后还需在目的基因两端添加含有限制酶酶切位点的碱基序列，若2链为转录时的模板链，则两端含酶切位点碱基序列的添加情况为_____。
(3)筛选导入目的基因成功的大肠杆菌，在培养基中加入_____。经研究发现，大肠杆菌对稀有密码子的利用率极低，如脯氨酸密码子CCC、甘氨酸密码子GGA、精氨酸密码子AGA和AGG，很少被使用。若目的基因中含有稀有密码子，会影响翻译的效率及产品的稳定性和功能。这样的稀有密码子在凝乳酶基因中也有，改造凝乳酶基因的思路是_____。
(4)发酵罐是发酵工程生产凝乳酶的反应器，其主要作用是_____（答出任意一点即可）。
(5)相对于从动物体内提取的方法获取凝乳酶，利用工程菌进行发酵工程生产具有_____等优点。（答出两点即可）