【推荐2】下图1是获取用于构建基因表达载体的含人生长激素基因的DNA片段(DNA复制子链延伸方向是5′→3′，转录方向为左→右)示意图，图2是所用质粒示意图，其上的Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^t表示四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列和酶切位点如下表。请据图回答：

限制酶识别序列和酶切位点表

限制酶	HindⅢ	BamHⅠ	PstⅠ	EcoRⅠ	SmaⅠ	BglⅡ
识别序列(5′→3′)	A↓AGCTT	G↓GATCC	C↓TGCAG	G↓AATTC	CCC↓GGG	A↓GATCT

(1) ①过程催化形成磷酸二酯键的酶有____________________，合成的人生长激素基因中________(选填“有”或“无”)与终止密码子相应的碱基序列。
(2) 引物1由5′→3′的碱基序列为________________________，引物2应含有限制酶________的识别序列；从图1的过程②开始进行PCR扩增，第六次循环结束时，图中用于构建基因表达载体的DNA片段所占比例是________。
(3) 在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成________种环状DNA。

(4) 2018年11月基因编辑婴儿事件震惊了世界，舆论一片哗然，某科研团队利用“CRISPR/Cas9”技术将受精卵中的艾滋病病毒受体基因CCR5进行修改，拟培育出具有艾滋病免疫能力的基因编辑婴儿。下图3为向导RNA引导Cas9蛋白切割CCR5基因(目标DNA)示意图。
①向导RNA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一种________酶。
②“GRISPR/Cas9”技术，是利用________法将Cas9蛋白和特定的引导序列导入受精卵中发挥基因编辑作用。
③基因编辑婴儿引起舆论的关注，很多科学家表示反对，请给出合理的理由______________。

【推荐3】我国科学家欲获得高效表达萝卜蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，进行了相关研究。检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因此通过PCR对蛋白A基因进行了定点诱变，过程如图1所示。图2为生产该微生物农药所用的质粒结构示意图。图3为转基因大肠杆菌在培养基中的生长情况。据此回答下列问题：

(1)通常情况下，PCR过程中添加引物的作用是使DNA聚合酶能_________。图1中引物B和引物C与普通引物不同的是______________。（写一点）
(2)若将新的蛋白A基因导入到图2所示的质粒中构建重组DNA，则扩增新的蛋白A基因时，最好在引物_____________的_____________（填“5′”或“3′”）端添加______________限制酶的酶切位点。
(3)结合图3分析，导入转新蛋白A基因的大肠杆菌应接种在_____________（填“固体”或“液体”） 培养基上，该培养基应添加____________以对其进行筛选。接种前通常采用____________法对培养基进行灭菌，该培养采用的接种方法是____________。
(4)鉴定图3的菌落中大肠杆菌是否产生了新的蛋白A的方法是____________。

【推荐1】阅读下面的材料，完成（1）～（5）题。
科研人员建立了一种新的靶向基因敲除技术——TALEN技术（原理见下图）。TALEN技术使用的基因敲除工具是由DNA识别域和核酸内切酶两个部分组成的蛋白质。科学家发现了一种细菌蛋白质（TALE），它的二连氨基酸（NI、NG、HD、NN，其中字母N、I、G、H、D分别代表了一种氨基酸）与四种碱基（A、G、C、T）有恒定的对应关系：NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。FokⅠ是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。因此，可以利用TALE作为DNA识别域，用FokⅠ二聚体定点切断DNA。

科学家发现水稻植株无论是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照条件下均表现为雄性可育。在长日照条件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。基因P只在单倍体花粉细胞中表达，使其能够合成淀粉。科研人员使用TALEN技术对水稻基因P进行靶向敲除，以得到光敏雄性不育水稻新品种。
（1）在TALEN技术的设计中，选择使用FokⅠ单体而不直接使用FokⅠ二聚体，这样能减少对DNA的__________切割，保证了基因敲除的靶向性。为了让TALEN技术能用于各种不同生物、不同基因的敲除，没有与TALE蛋白结合的FokⅠ二聚体对DNA的切割应__________（选填“具有”或“不具有”）类似于限制酶的“限制性”。
（2）若TALE蛋白左臂所识别的基因P的序列为“-TGACC-” ，则TALE蛋白左臂对应的二连氨基酸序列应为__________。用这种方法，可以确定TALE蛋白的氨基酸序列，进而人工合成TALE蛋白基因。然后将TALE蛋白基因与__________基因进行融合，得到融合基因。

（3）科研人员用图2所示的质粒为载体，其中的潮霉素抗性作为标记基因，作用是__________。应选用__________酶将该质粒与融合基因构建为重组质粒，并将融合基因设法导入到水稻愈伤组织中，再利用__________技术获得T₀代植株。
（4）由于基因靶向敲除成功的概率比较低，所以科研人员培育T₀代植株时应保证__________日照条件，待其自花受粉得到T₁代，再将T₁代植株__________，并在开花期随机选择一部分植株的花粉进行鉴定，鉴定方法是__________。若观察到某植株的花粉全部未被染成蓝色，则该植株为所需的纯合光敏雄性不育新品种。
（5）与传统的雄性不育水稻品种相比，光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖并保留雄性不育特性，这是因为__________。

【推荐1】结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性肠蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
(1)小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。

组别	主要操作	培养细胞后，使之破裂
对照组1	空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌	细胞培养72小时后，加入③___________，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2	含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①___________
实验组	②___________，接种等量的结核杆菌

取三组实验等量的细胞裂解液，用稀释涂布平板法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是___________。

(2)非致病性胱蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据___________设计引物进行PCR，并用___________作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。

(3)用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1、___________、2、___________。经检测，山羊成纤维细胞中非致病性脱蛋白基因和SP110基因的表达情况是___________（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。

(4)欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有___________（至少写出两项）。

【推荐3】人类y基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A 蛋白后，y基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对y基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

   

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F₁～F₇末端添加的序列所对应的限制酶是____，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____。PCR缓冲体系中除图示条件外还要加入____（至少2个）。获得扩增产物后，应选择限制酶____切割载体。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
(2)将构建的载体导入____（选填“保留”、“除去”）BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含F₁～F₆与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F₇与R扩增产物的受体细胞无荧光。据图分析，构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCLIIA基因转录时的模板链在____（选填“相同”、“不同”）的DNA链上，含F₇与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____。
(3)向培养液中添加适量的____，含F₁～F₄与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F₅～F₆与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物____在调控序列上所对应序列之间的区段上，理由是____。